分析显示，人类rs1421085变异的T等位基因与小鼠同源位点具有高度的相似性。为了明确人类rs1421085 T>C变异的生物学功能，研究人员利用了赛业生物提供的由CRISPR/Cas9系统构建的携带同源单核苷酸突变的全身性基因敲入（KI）小鼠模型（KI^Cas9，图1b）。在喂食高脂饮食后，雄性KI^Cas9小鼠的体重增加和脂肪含量少于野生型对照小鼠，特别是腹股沟白色脂肪组织（iWAT）。

为了进一步证实该变异的肥胖保护作用，他们又采用基因靶向策略，以小鼠胚胎干细胞为基础构建了第二种全身性同源rs1421085_C KI小鼠模型（KI^ES，图1e，赛业生物提供）。与对照相比，KI^ES小鼠在高脂饮食条件下体重增加较少，脂肪量较少，且肝脏脂肪积累较少，与KI^Cas9小鼠的表型高度相似。与野生型小鼠相比，KI^ES小鼠的总能量消耗明显增加。这些结果表明，rs1421085 T>C变异KI小鼠增加了总的能量消耗，并抵抗了高脂饮食诱导的肥胖。

图1 同源rs1421085 T>C变异促进了能量消耗，并抵抗了高脂饮食诱导的肥胖^[1]

研究人员注意到，KI^Cas9小鼠棕色脂肪组织（BAT）中的脂肪细胞更小更密。同时，KI^Cas9小鼠BAT中产热相关基因的表达也显著增加，包括Ucp1、Pgc-1α、Prdm16等。他们随后从BAT中分离出基质血管成分（SVF），并在体外诱导为成熟的棕色脂肪细胞。与对照相比，KI^Cas9和KI^ES小鼠模型的棕色脂肪细胞的产热能力增强，表现为产热相关基因的表达增加以及耗氧率增加。这些体内和体外的结果表明，同源rs1421085 T>C变异增强了棕色脂肪细胞的产热。

为了验证BAT中的同源rs1421085 T>C变异是否对肥胖抵抗表型有重要贡献，研究人员将同源rs1421085^floxp/floxp（KI^fl/fl）小鼠与Ucp1-Cre小鼠杂交，构建了棕色脂肪细胞特异性的rs1421085 T>C KI小鼠模型（图2，赛业生物提供）。与两个全身性KI模型相似，Ucp1-KI^fl/fl小鼠对高脂饮食诱导的肥胖也表现出抵抗力。值得注意的是，Ucp1-KI^fl/fl小鼠的总能量消耗与对照相比显著增加，且脂滴变小，线粒体增加，Ucp1等产热相关基因的表达也增加。综合这三种KI模型的表型，研究人员认为同源rs1421085 T>C变异增强了棕色脂肪细胞的产热，并抵抗了高脂饮食诱导的肥胖。

图2 棕色脂肪细胞特异性的变异敲入抵抗了高脂饮食诱导的肥胖^[1]

那么，rs1421085 T>C变异会对哪些基因的表达产生影响？rs1421085位点附近的几个基因（包括IRX3/IRX5/IRX6基因簇、RPGRIP1L和FTO）被认为是FTO变异的下游候选目标。于是，研究人员评估了这些基因在三种KI小鼠模型的BAT中的表达情况，发现Fto在mRNA和蛋白质水平上的表达都显著提高。

之前的研究发现，包含rs1421085的“次要等位基因”的1-kb基因组区域显示出比主要等位基因更高的增强子活性。因此，他们构建了携带1-kb人类基因组片段的报告质粒，正向或反向插入人类FTO启动子序列的前方。当反向连接时，携带T（主要）或C（次要）等位基因的片段都增强了FTO启动子的活性，且携带C等位基因的片段表现出更高的活性（图3）。通过染色质构象捕获（3C-qPCR）分析，他们发现KI^ES小鼠（C-等位基因携带者）棕色脂肪细胞与Fto启动子的相互作用频率高于野生型小鼠（T-等位基因携带者）。这一结果表明，rs1421085 T>C变异导致增强子区域与Fto启动子之间形成更强的染色质环。

图3 同源rs1421085 T>C变异通过上调Fto表达而增加产热^[1]

为了证实FTO在棕色脂肪细胞中的功能，研究人员利用shRNA抑制了原代小鼠棕色脂肪细胞中Fto的表达。Fto的敲减显著降低了Ucp1等产热相关基因的表达，而FTO的过表达则提高了产热相关基因的表达。由此可见，FTO促进了棕色脂肪细胞的产热。此外，当Fto被沉默或抑制时，KI^ES棕色脂肪细胞中检测到的Ucp1表达增加和耗氧率增加都在很大程度上被抑制。这些结果显示，同源rs1421085 T>C变异主要通过上调FTO表达来增强棕色脂肪细胞产热和Ucp1表达。

最后，研究人员评估了小鼠中rs1421085 T>C变异对肥胖的影响是否与BAT激活程度有关，因为小鼠一直都拥有热激活的BAT，而人类的BAT激活在出生时就达到顶峰。他们给KI^ES小鼠和野生型小鼠投喂高脂饮食，并将其置于不同温度下。值得注意的是，22°C时观察到的组间体重差异在30°C（热中性）时基本消失，而30°C时KI^ES小鼠的脂肪量和脂肪组织量与野生型小鼠相当，表明当BAT失活时，热中性可以减弱rs1421085 T>C变异对能量消耗和肥胖的影响。不过，同样在30°C下，KI^ES小鼠注射CL316,243后的总能量消耗增加，背表面温度升高，表明rs1421085 T>C变异促进了BAT产热。

这项研究采用三种rs1421085 T>C KI小鼠模型来探索FTO rs1421085 T>C变异的功能。在收集这些转基因小鼠模型的体内和体外证据后，研究人员发现rs1421085 T>C变异通过Fto–Ucp1轴来调控BAT产热和肥胖。这一证据支持了rs1421085 T>C变异通过增强具有功能性BAT的哺乳动物的产热来对抗寒冷。