本期罕见病十宗罪我们要关注的是肌营养不良症，这是指一组以进行性加重的肌无力和支配运动的肌肉变性为特征的遗传性疾病群。前不久，作为首个用于治疗杜氏肌营养不良症的基因疗法，新药SRP-9001获得FDA加速批准上市的消息受到人们的持续关注，这里的杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）即是肌营养不良症的其中一种。

 

除了DMD以外，肌营养不良症关注度较高的类型还有面肩肱型肌营养不良症（Facioscapulohumeral muscular dystrophy, FSHD）、肌强直性营养不良症（Myotonic dystrophy, DM）、肢带型肌营养不良症（Limb-girdle muscular dystrophy, LGMD）等，接下来，我们从致病机理及基因治疗方面看看肌营养不良症的“四大天王”。

 

DMD的致病机理及基因治疗

DMD致病基因十分明确，即编码产生抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的基因DMD，它对人类正常肌肉结构和功能中是不可或缺的，而DMD患者中的DMD基因发生突变，主要是以基因缺失为主，导致DMD不能正常表达和发挥功能。

 

目前，针对DMD的基因疗法主要类型包括CRISPR、ASO、AAV等。特别是对于CRISPR、ASO基因疗法^[1]，因为药物涉及对人核酸序列的编辑，故需要与人类核酸序列一致性更高的动物模型，但由于非人类灵长动物价格昂贵，全基因组人源化小鼠成为了更高效、特异的基因治疗相关药物的临床前试验动物。

 

为此，赛业生物自主研发了几款hDMD模型，均覆盖了DMD基因热点突变区域及药物靶点区域。除了热门区域野生型人源化模型以外，我们还在此基础上再修饰构建了热门点突变人源化模型，可以同时提供更加理想的人源化对照及疾病模型。赛业生物关于DMD的基础人源化品系和点突变模型：拥有热点突变区域的野生型及在此基础上构建的点突变人源化疾病模型；可以直接在已有的野生型人源化基础上定制不同的点突变，提高效率及成功率；人源化区域包括大部分药物靶向区域，更适合可用于药物筛选及药效研究，特别是ASO、CRISPR、siRNA等基因治疗相关药物；人DMD基因原位插入，拷贝数确定，可稳定遗传。

 

 

FSHD的致病机理及基因治疗

FSHD分为FSHD1和FSHD2两种类型，尽管其致病机制不同，但最终结果都是DUX4(Double homeo- box 4)基因在骨骼肌中异常表达或DUX4蛋白功能异常。患者中95%为1型，FSHD1型的致病原因主要与4号染色体长臂亚端粒区内的D4Z4大卫星串联重复序列的多拷贝缺失相关，导致DUX4基因的甲基化程度降低，使其在骨骼肌中去抑制重新表达而致病。

 

基因治疗主要以通过ASO和siRNA抑制毒蛋白DUX4表达为主^[2]，使用到的模型有两类，分别是FLExDUX4小鼠（诱导型）^[3]和注射AAV表达DUX4小鼠^[4]，赛业生物自主研发AAV表达DUX4小鼠模型，可更好地用于基因治疗药物临床前研究。

 

DM的致病机理及基因治疗

DM分为DM1和DM2两种类型，其中DM1占绝大多数，致病机理是由DMPK基因3’非翻译区不稳定的CTG重复片段异常扩增导致RNA结合蛋白调节紊乱、mRNA异常剪接，相应引起多种组织缺陷，进而出现DM多系统受累。基因治疗主要以通过ASO和siRNA抑制DMPK表达为主，使用的模型以DMPK转基因（带有多个CTG重复）^[5]和HSALR转基因小鼠^[6]为主，赛业生物自主构建了这两种转基因模型，可适用于DM1临床前研究。

 

LGMD的致病机理及基因治疗

LGMD是一类以肢带区域或肩膀和臀部周围的肌肉萎缩为主要症状的神经肌肉疾病的统称，一般将LGMD分为常染色体显性遗传1型和常染色隐性遗传2型。致病基因大多与影响肌肉功能性蛋白质产生的基因突变有关，主要有DYSF、SCGA、SGCB等。基因治疗主要通过AAV递送疗法来补充缺失蛋白来治疗，当然文献中也有一些关于ASO跳跃疗法的研究。基于致病机理及基因疗法，赛业生物自主研发了hDYSF（WT、MU）、Dysf-KO、Scgs-KO、Sgcb-KO等^[7]小鼠模型，用于助力LGMD疾病的临床前药物研发。

 

HUGO-GT^TM全基因组人源化模型构建计划

不仅是肌营养不良症，针对视网膜色素变性（RP）、黄斑变性（AMD）、帕金森病（PD）等多种疾病类型，如果要深入研究其致病机理，长片段甚至全基因组人源化小鼠是更好的选择。但全基因组替换所需的技术难度高，大规模引入的外源序列可能会影响原本基因的表达调控。

 

为此，赛业生物启动了HUGO-GT^TM计划，基于自主研发的TurboKnockout-Pro技术，对鼠源基因实现原位替换，成功构建了涵盖更丰富干预靶点的全基因组人源化小鼠。HUGO-GT^TM小鼠搭载了更高效的大片段载体融合技术，可以作为万能模板进行针对性的突变定制服务，是更贴近真实世界生物机制的药物临床前研究模型。

 

注：HUGO-GT^TM即Humanized Genomic Ortholog for Gene Therapy

 

参考文献

[1] Lee T , Awano H , Yagi M ,et al.2′-O-Methyl RNA/Ethylene-Bridged Nucleic Acid Chimera Antisense Oligonucleotides to Induce Dystrophin Exon 45 Skipping[J].Genes, 2017, 8(2):67.DOI:10.3390/genes8020067.

[2] Lim K R Q , Maruyama R , Echigoya Y ,et al.Inhibition of DUX4 expression with antisense LNA gapmers as a therapy for facioscapulohumeral muscular dystrophy (vol 117, pg 16509, 2020)[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.  2020(35):117.

[3] Jones T I , Chew G L , Barraza-Flores P ,et al.transgenic mice expressing tunable levels of dux4 develop characteristic facioscapulohumeral muscular dystrophy-like pathophysiology ranging in severity title: fshd-like transgenic mouse models of varying severity[J].  2019.DOI:10.1371/journal.pone.0150938.

[4] Ba L M W , Garwick S E , Mei W ,et al.DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo.[J].Annals of Neurology, 2011, 69(3):540-552.DOI:10.1002/ana.22275.

[5] Mahadevan M S , Yadava R S , Yu Q ,et al.Reversible model of RNA toxicity and cardiac conduction defects in myotonic dystrophy.[J].Nature Genetics, 2006, 38(9):1066.DOI:10.1038/ng1857.

[6]Mankodi A, Logigian E, Callahan L, McClain C, White R, Henderson D, Krym M, Thornton CA. Myotonic dystrophy in transgenic mice expressing an expanded CUG repeat. Science. 2000 Sep 8;289(5485):1769-73. doi: 10.1126/science.289.5485.1769. PMID: 10976074.

[7]Jakub,Malcher,Leonie,et al.Exon Skipping in a Dysf-Missense Mutant Mouse Model.[J].Molecular Therapy Nucleic Acids, 2018.DOI:10.1016/j.omtn.2018.08.013.