RNAi治疗的龙头企业Alnylam日前公布的2023年业绩显示，其两款靶向TTR治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变（ATTR）的siRNA药物Patisiran和Vutrisiran年累计销售额超65亿人民币[1]。全球ATTR患者为25万至55万[2]，ATTR心肌病（ATTR-CM）患者数量更多，但Patisiran和Vutrisiran目前仅获批用于ATTR多发性神经病（ATTR-PN）治疗。为此，Alnylam正在开展Patisiran和Vutrisiran治疗ATTR-CM的临床试验。同时，多家药企也在开发TTR靶向的小核酸、小分子、抗体或基因编辑疗法，靶向TTR治疗ATTR的药物研发竞争正处于白热化阶段。
图1 ATTR淀粉样变性的发病机制和临床表现[3]
TTR蛋白与转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）
ATTR是一种由转甲状腺素蛋白（TTR）错误折叠引起的致死性疾病。TTR蛋白在正常情况下以四聚体形式存在于外周血中，负责运输甲状腺素和视黄醇结合蛋白。在ATTR患者体内，TTR蛋白会错误折叠并聚集成淀粉样物质，这些淀粉样纤维会沉积于组织和器官中，导致器官功能障碍、衰竭，甚至死亡[4]。根据TTR基因是否存在突变，ATTR可分为遗传性/突变型（ATTRv）和非遗传性/野生型（ATTRwt）[5]。
图2 ATTRwt和ATTRv不同的发病概率和临床表现[6]
ATTRv由TTR基因的致病性遗传突变引起，可以在20岁至80岁的任何年龄发病。突变导致TTR蛋白从四聚体状态解离为单体，然后错误折叠并聚集成淀粉样物质，最终在心脏、神经和肾脏等器官中积累。相反，ATTRwt不存在TTR基因突变，而是由与年龄相关的平衡机制失效引起。随着衰老等因素的影响，野生型TTR蛋白可能形成与突变型TTR蛋白类似的错误折叠。ATTRwt通常在65岁以后发病，因此也被称为老年性系统性淀粉样变性。
靶向TTR基因和蛋白治疗ATTR
ATTR治疗药物研发主要集中在抑制TTR蛋白合成、稳定TTR蛋白四聚体结构或清除错误折叠的TTR蛋白等方向[7]。其中，小核酸和基因编辑是热门的治疗方法。多款反义寡核苷酸（ASO）和小干扰RNA（siRNA）药物已被证明能有效抑制突变型和/或野生型TTR蛋白的合成，并改善患者疾病表型，多款药物已成功获批上市。此外，利用CRISPR等基因编辑技术来减少TTR基因表达的疗法也取得了令人鼓舞的早期临床结果[8]。
图3 靶向TTR基因和蛋白治疗ATTR的多种创新疗法[8]
小核酸和基因编辑疗法都靶向人源基因进行改造，例如Patisiran旨在靶向并沉默TTR mRNA的3'UTR ，从而阻断TTR蛋白的生成。因此对小鼠基因进行人源化修饰是用于临床前研究必不可少的动物模型。赛业生物开发了两种小鼠Ttr基因人源化模型，一种是B6-hTTR小鼠（产品编号：C001512），表达人类野生型TTR基因；另一种是H11-Alb-hTTR*V50M小鼠（产品编号：C001525），过表达携带p.V50M致病突变的人类TTR基因。这两种模型均能满足在ATTRwt和ATTRv治疗研究中大多数基因编辑、ASO和siRNA疗法的需求。以下是这两个模型的详细信息。
B6-hTTR小鼠成功表达人源TTR基因和蛋白
RT-qPCR和ELISA检测显示，B6-hTTR小鼠成功表达人源化TTR基因和蛋白，且不存在小鼠内源性Ttr基因的表达。
图4 B6-hTTR小鼠体内人源TTR基因和蛋白表达的检测
B6-hTTR小鼠用于小核酸药物的药效评价
Vutrisiran是一款siRNA药物，能够结合并降解野生型和突变型人源TTR mRNA，于2022年获得了用于治疗成人遗传性ATTR-PN的批准[9]。验证数据表明，单次皮下注射Vutrisiran后，B6-hTTR小鼠血浆中的人源TTR蛋白表达量显著低于对照组。
图5 B6-hTTR小鼠用于小核酸药物Vutrisiran的体内药效测试
H11-Alb-hTTR*V50M小鼠表达人源突变TTR基因和蛋白
H11-Alb-hTTR*V50M小鼠通过在小鼠H11安全位点插入携带p.V50M致病突变的人类TTR基因而构建。该模型成功地表达人源TTR基因和蛋白，而且其在体内的表达水平远超过B6-hTTR小鼠。
图6 H11-Alb-hTTR*V50M小鼠体内人源TTR基因和蛋白表达的检测
总 结
B6-hTTR小鼠（产品编号：C001512）和H11-Alb-hTTR*V50M小鼠（产品编号：C001525）均成功表达人源TTR基因和蛋白，小鼠模型的TTR mRNA可以被靶向人源TTR的小核酸药物成功结合，从而抑制其翻译表达，降低小鼠体内人源TTR蛋白水平。因此，这两种小鼠模型是研究ATTR疾病机制和评估靶向药物药效的有效工具，特别是在需要精准靶向人源TTR基因和mRNA的CRISPR基因编辑疗法、反义寡核苷酸（ASO）或小干扰RNA（siRNA）药物的研发过程中。
此外，赛业生物利用自主研发的TurboKnockout融合BAC重组技术，可以在B6-hTTR小鼠的基础上提供定制服务，根据不同的点突变构建其他热门人源化点突变疾病模型，以满足研发人员对靶向不同TTR致病突变的精准疗法的药物筛选和药效学等实验的需求。
参考文献：
[1]Alnylam Pharmaceuticals, Inc. (2024, February 15). Alnylam Pharmaceuticals Reports Fourth Quarter and Full Year 2023 Financial Results and Highlights Recent Period Activity [Press release]. Retrieved from https://investors.alnylam.com/press-release?id=27941
[2]Gillmore JD, Gane E, Taubel J, Kao J, Fontana M, Maitland ML, Seitzer J, O'Connell D, Walsh KR, Wood K, Phillips J, Xu Y, Amaral A, Boyd AP, Cehelsky JE, McKee MD, Schiermeier A, Harari O, Murphy A, Kyratsous CA, Zambrowicz B, Soltys R, Gutstein DE, Leonard J, Sepp-Lorenzino L, Lebwohl D. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. N Engl J Med. 2021 Aug 5;385(6):493-502.
[3]Ibrahim RB, Liu YT, Yeh SY, Tsai JW. Contributions of Animal Models to the Mechanisms and Therapies of Transthyretin Amyloidosis. Front Physiol. 2019 Apr 2;10:338.
[4]Nativi-Nicolau JN, Karam C, Khella S, Maurer MS. Screening for ATTR amyloidosis in the clinic: overlapping disorders, misdiagnosis, and multiorgan awareness. Heart Fail Rev. 2022 May;27(3):785-793.
[5]Koike H, Katsuno M. Transthyretin Amyloidosis: Update on the Clinical Spectrum, Pathogenesis, and Disease-Modifying Therapies. Neurol Ther. 2020 Dec;9(2):317-333.
[6]Merino-Merino AM, Labrador-Gomez J, Sanchez-Corral E, Delgado-Lopez PD, Perez-Rivera JA. Utility of Genetic Testing in Patients with Transthyretin Amyloid Cardiomyopathy: A Brief Review. Biomedicines. 2023 Dec 21;12(1):25.
[7]Aimo A, Castiglione V, Rapezzi C, Franzini M, Panichella G, Vergaro G, Gillmore J, Fontana M, Passino C, Emdin M. RNA-targeting and gene editing therapies for transthyretin amyloidosis. Nat Rev Cardiol. 2022 Oct;19(10):655-667.
[8]Tomasoni D, Bonfioli GB, Aimo A, Adamo M, Canepa M, Inciardi RM, Lombardi CM, Nardi M, Pagnesi M, Riccardi M, Vergaro G, Vizzardi E, Emdin M, Metra M. Treating amyloid transthyretin cardiomyopathy: lessons learned from clinical trials. Front Cardiovasc Med. 2023 May 23;10:1154594.
[9]Keam SJ. Vutrisiran: First Approval. Drugs. 2022 Sep;82(13):1419-1425.
