腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）是一种常用的工具病毒，因其具有低免疫原性、高安全性及感染宿主范围广等特点，被广泛应用于各种体内研究，例如，将携带有特定基因序列的AAV注射至小鼠体内，实现目的基因的过表达、敲低或敲除。近年来，基因治疗领域发展迅速，无论是基础研究还是产业转化都取得了重大突破，而AAV是基因治疗最重要的一种递送载体。据统计，目前正在进行的基因治疗临床试验中，AAV占了所有病毒载体的一半以上。这除了AAV具有体内安全性高的优势外，还有个很重要的因素是，AAV具有良好的组织特异性。

 

基因的表达具有组织特异性，即同一基因在不同种类的组织或细胞中表达存在差异。在我们进行基因功能研究时，常需要在小鼠体内对目的基因进行组织特异性调控，即在特定的组织或细胞中表达外源序列而不影响其他组织。

 

那么，通过AAV实现体内特异性调控要怎么做呢？常见的有4种策略：通过原位注射、组织特异性血清型、特异性启动子和Cre-loxp系统，下面就来给大家一一介绍。

 

原位注射

原位注射，顾名思义就是直接将AAV注射到想要表达的组织中，如脑立体定位注射、肌肉注射、心肌注射等。原位注射可让AAV对目标组织快速感染，并很少扩散至全身，从而降低对其他正常组织器官的影响。但可进行原位注射的组织要求是足够厚实的实质组织或相对封闭的腔间隙，因此目前能进行AAV原位注射的组织类型并不多，而且像脑立体定位注射、玻璃体腔内注射等原位注射具有较高的操作门槛。

 

目前常用组织原位注射方式如下表所示：

表1. 不同组织原位注射方式^[1]

 

组织特异性血清型

AAV的血清型主要由AAV衣壳蛋白的结构所决定，不同的衣壳蛋白结构识别不同的细胞表面受体，因此不同血清型的AAV会影响其感染效率、组织亲和性以及开始表达的时间等。

表2. 部分AAV组织特异性血清型^[2]

 

从上表可看出，目前AAV的血清型种类并不多，因此科学家也在积极地对AAV衣壳蛋白进行改造，开发出更多的、对特定组织感染能力更强的血清型AAV。例如，研究人员开发出了一种可用于耳聋基因治疗的AAV新变体，命名为AAV-ie（AAV-inner ear），其能够高效靶向小鼠内耳组织，且在内耳支持细胞上表现出比AAV1、AAV6、AAV8、AAV-DJ等血清型具有更高的感染效率。

 

图1. AAV-ie能高效感染耳蜗支持细胞^[3]

 

组织特异性启动子

虽然不同血清型AAV对不同组织的感染具有倾向性，但仍难避免感染其他非靶向组织，这时候便需要利用多种组织或细胞特异性启动子来提高AAV的特异性。组织特异性启动子是指在该启动子调控下，外源基因一般只在某些特定的器官或组织部位表达。Bilal等采用Cre重组酶双荧光报告基因小鼠（mT/mG）作为实验动物，研究NPPA和Myl2启动子在心脏腔室特异性活性，最后将AAV9基因特异性表达载体应用在心脏腔室中进行基因特异性表达研究，促进人们对心脏病的了解，有助于心脏病基因疗法的开发。

 

 

图2. Nppa和Myl2启动子插入表达Cre的AAV9载体中^[4]

 

Cre-loxp系统

除此之外，基于Cre-loxp系统的AAV和工具小鼠联用方案也被越来越多的应用。Cre是一种重组酶，可以识别催化两个Loxp位点之间的片段发生同源重组，并根据两个loxp位点的方向，造成DNA的缺失、易位等现象。从而实现目的基因的基因敲除、序列翻转以及基因转座。

 

因此，我们可向Cre小鼠中注射含loxp位点的AAV，从而在小鼠体内实现目的基因过表达或干扰表达；同样，我们可向含loxp位点的flox小鼠中注射可表达Cre的AAV，从而实现目的基因的敲除。

 

Sun等使用 Cre-loxp系统注射到小鼠VMH（腹内侧下丘脑）中，特异性敲除初级纤毛相关基因，并观察到了小鼠的代谢失调和骨骼稳态异常，从而证实其在调节能量和骨骼稳态中具有至关重要的作用。

 

图3. VMH特异性初级纤毛KO小鼠骨骼生长增加^[5]

 

小结

综上所述，我们对四种AAV的组织特异性调控策略进行了如下总结：

表3. 四种策略综合比较

 

在实际研究中，大家可根据实际实验需求选择合适的特异性策略，也可联合多种特异性调控策略，多管齐下。例如，同时采用原位注射+特定血清型+特异性启动子。三重保证体内基因的特异性调控。

 

参考文献：

[1]高凯, 王军志. 不同血清型腺相关病毒载体组织表达差异的研究进展[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2007, 14(004):388-392.

[2]Zincarelli, Carmela et al. “Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.” Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16,6 (2008): 1073-80. doi:10.1038/mt.2008.76

[3]Tan, Fangzhi et al. “AAV-ie enables safe and efficient gene transfer to inner ear cells.” Nature communications. 10,1 3733. 19 Aug. 2019, doi:10.1038/s41467-019-11687-8

[4]Bilal, Alina S et al. “Optimizing Adeno-Associated Virus Serotype 9 for Studies of Cardiac Chamber-Specific Gene Regulation.” Circulation. 143,20(2021):2025-2027. doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.120.052437

[5]Sun, Ji Su et al. “Ventromedial hypothalamic primary cilia control energy and skeletal homeostasis.”The Journal of clinical investigation.131,1(2021):e138107. doi:10.1172/JCI138107