YAP（Yes相关蛋白）是一种转录共激活蛋白。它通过从细胞质转位到细胞核而激活，从而调节基因表达并促进肿瘤发生。在细胞核内，YAP与TEAD、MAML1/2等伴侣蛋白的结合可促进YAP的细胞核滞留，进而刺激细胞增殖、存活和迁移，并驱动耐药性。
然而，与果蝇同源物Yorkie不同，目前尚未在哺乳动物YAP蛋白中发现经典的核定位信号（NLS）。那么，这就带来了一个有趣的问题，哺乳动物细胞中的YAP是如何入核的？
近日，海军军医大学第二附属医院谢渭芬、张新团队和中国科学院上海药物研究所罗成团队合作，在《Signal Transduction and Targeted Therapy》杂志（IF=39）上发表论文，回答了这个问题。
这项研究首次证明了SOX9是驱动YAP核转位的关键调节因子，并提出了通过靶向SOX9-YAP相互作用来治疗YAP驱动癌症的潜在策略。
图片来源：《Signal Transduction and Targeted Therapy》
（https://doi.org/10.1038/s41392-024-01805-4）
研究材料与方法
在这项研究中，研究人员从肝细胞癌（HCC）细胞着手开展研究。他们委托赛业生物构建了敲除SOX9的Huh-7细胞和HEK-293细胞，并利用过表达SOX9和YAP的慢病毒载体来评估蛋白功能。他们利用免疫共沉淀、体外pull-down分析、邻位连接分析（PLA）和微量热涌动（MST）分析等来探究蛋白之间的相互作用。
技术路线
1、利用SOX9基因敲除和过表达来研究SOX9对YAP活性的影响
2、分析SOX9与YAP之间的相互作用，验证SOX9促进YAP核转位的假设
3、通过蛋白突变分析探索SOX9与YAP相互作用的分子基础
4、开发竞争性多肽来破坏SOX9-YAP相互作用，并评估该多肽对肿瘤生长的影响
研究结果
1、SOX9通过直接相互作用促进YAP的核转位
作为一种转录因子，SOX9在多个生物过程中发挥关键作用。YAP和SOX9在许多肿瘤中被异常上调，成为推动肿瘤进展的关键调节因子。最近的研究发现，SOX9可能是YAP活性的正调节因子，具体取决于细胞微环境和肿瘤异质性。不过，SOX9是否会影响YAP的核转位，目前仍有待探索。
为了评估SOX9是否会影响YAP的激活，研究人员委托赛业生物构建了SOX9基因敲除（SOX9KO）的Huh-7细胞。RNA测序数据显示，在SOX9KO细胞中，YAP相关通路和YAP靶基因受到全面抑制。利用表达YAP的慢病毒感染Huh-7细胞后，他们观察到SOX9的缺失明显抑制了Huh-7细胞的增殖、迁移和侵袭。SOX9表达的升高显著增强了YAP靶基因的转录。这些结果确定了SOX9是肝细胞癌进展过程中YAP功能的强效调节因子。
研究人员接着检测了SOX9和YAP在肝细胞癌组织中的表达情况，以探索SOX9调节YAP功能的潜在机制。他们发现，YAP的细胞核水平与SOX9呈正相关（图1）。敲除SOX9会抑制Huh-7和HEK-293细胞中YAP的核转位，并降低YAP-TEAD的转录活性（其中HEK-293细胞也由赛业生物提供）；相反，过表达SOX9则会显著增强细胞中的YAP活性并提高YAP的细胞核水平。
他们还观察到，SOX9和YAP的共表达可促进YAP的核转位，若SOX9未表达，则几乎观察不到YAP的核转位。这些数据表明，YAP的核转位需要SOX9。免疫共沉淀和体外pull-down分析证明，SOX9和YAP之间存在直接的相互作用。邻位连接分析（PLA）的结果也证实，细胞在感染了表达SOX9的慢病毒后，内源YAP和外源SOX9的聚集逐渐从细胞质转移至细胞核（图1）。这些结果支持了SOX9与YAP的直接相互作用促进YAP核转位的假设。
图1 SOX9通过与YAP直接相互作用来促进YAP的核转位[1]
2、SOX9与YAP相互作用的分子基础
接下来，研究人员探究了SOX9与YAP相互作用的分子基础。他们发现，含有HMG结构域（aa 94-210）的SOX9片段参与了YAP与SOX9的相互作用。进一步的分析表明，SOX9的HMG结构域中的N端NLS（aa 94-126）与YAP之间存在高亲和力相互作用（图2）。
之后，通过一系列分析，他们发现D125A突变降低了SOX9诱导的YAP在Huh-7细胞中的核转位和活性，也明显降低了SOX9对YAP诱导的转录激活和HCC细胞增殖的影响。这些结果表明D125残基是SOX9-YAP相互作用所必需的，也证实SOX9充当了YAP的细胞核“穿梭巴士”。
图2 SOX9的Asp-125残基是SOX9诱导YAP核转位所必需的[1]
分子对接分析表明，SOX9的D125残基同时与YAP的R124和S127相互作用。研究人员发现，R124K突变而非S127A突变显著削弱了YAP与SOX9的相互作用。此外，R124K突变也显著阻碍了YAP入核，并降低了YAP-TEAD的转录激活。与这些结果相一致的是，R124K突变也减少了YAP诱导的恶性增殖以及YAP在Huh-7细胞中的致癌作用。
他们之后使用了过表达YAP或YAPR124K的肝细胞特异性YAP基因敲除（YapHKO）小鼠，采用二乙基亚硝胺加四氯化碳法诱导小鼠患上肝细胞癌。所有YapHKO+hYAP小鼠（5/5）都形成了肉眼可见的肿瘤，而五只YapHKO+R124K小鼠中只有两只出现了小的肿瘤结节。这些数据表明，YAP的R124是YAP与SOX9相互作用的关键氨基酸，因此会影响YAP的致癌活性。
此外，研究人员还在HCC细胞和HCC标本中检测到YAP在R124位点的不对称二甲基化（YAP-R124me2a）。他们发现，精氨酸甲基转移酶PRMT1与YAP直接结合，催化了YAP-R124的不对称二甲基化。微量热涌动（MST）分析显示，YAP多肽（aa 115-135）与SOX9-HMG结构域的结合亲和力在R124me2a修饰后增加，但在R124K突变后消失，表明YAP-R124的不对称二甲基化增强了YAP与SOX9的相互作用。
越来越多的研究表明，YAP的激活对许多癌症的进展至关重要，但YAP的mRNA表达水平和蛋白水平与癌症患者的总生存期并无明显相关性。研究人员发现，与周围的非癌变组织相比，HCC组织中YAP-R124me2a的水平显著升高。重要的是，高水平的YAP-R124me2a与HCC患者的不良预后显著相关。这些结果表明，YAP-R124me2a有望作为多种腺癌的生物标志物和治疗靶点。
3、竞争性多肽可破坏SOX9与YAP的相互作用
基于以上这些结果，研究人员设计出一种多肽Pep-S-A1，包含参与SOX9-YAP相互作用的关键残基D125。分析表明，Pep-S-A1以剂量依赖的方式破坏了HCC细胞中YAP与SOX9的相互作用。用Pep-S-A1处理Huh-7细胞可降低YAP的细胞核水平并抑制YAP靶基因的表达。在体外和体内实验中，Pep-S-A1都能够抑制肿瘤生长。这些数据表明，破坏YAP与SOX9的相互作用可能是一种很有前景的肿瘤治疗策略（图3）。
图3 SOX9通过直接相互作用触发YAP入核的机制示意图[1]
研究结论
总的来说，这项研究揭示了SOX9一种之前从未发现的功能，作为关键癌基因的“摆渡”调节因子。同时，研究也阐明了YAP入核的分子机制。研究还表明，PRMT1催化的YAP-R124me2a可促进YAP核转位，并作为预测癌症患者生存结果的通用标志物。更重要的是，研究人员还发现SOX9-YAP复合物的解离是治疗YAP驱动癌症的潜在方法。
参考文献：
[1]Qian, H., Ding, CH., Liu, F. et al. SRY-Box transcription factor 9 triggers YAP nuclear entry via direct interaction in tumors. Sig Transduct Target Ther 9, 96 (2024). https://doi.org/10.1038/s41392-024-01805-4
