可变剪接是Pre-mRNA通过不同的剪切方式将外显子重连，形成不同mRNA，并产生不同种类蛋白的现象。由于可变剪切的存在，使得一个基因可以编码多种不同的蛋白质。

可变剪切的发生是一个调控精密的过程，受到剪切蛋白基因特定序列（顺式作用元件）的影响，即使是微小的变化如单碱基突变都可能导致异常剪切的发生。比如我们较为熟知的杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophhy, DMD)和脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy,SMA）这两种罕见病，其发病机制都与异常可变剪切密切相关。

当我们通过检测临床样品，获得一些可能与可变剪接相关的突变位点时，应该怎样开展验证呢？下面给大家介绍。

可变剪接的产生，是调控剪接的蛋白和存在于内含子和外显子的顺式作用元件相互作用的结果。它们包括内含子剪切增强子(ISE)、内含子剪切沉默子(ISE)、外显子剪切增强子(ESE)、 外显子剪切沉默子 (ESS)和AG-exon-GT保守序列等，这些顺式作用元件能与相应的蛋白结合，调控外显子拼接的准确性和效率。另外，调控剪接蛋白的表达往往会存在时空特异性，即在不同发育阶段和组织部位，相同蛋白的表达模式也会存在差异，这样就可能产生不同的剪接类型。

当这些顺式作用元件的序列发生突变，即使是点突变，也可能产生异常的剪接类型。常见的异常剪接类型包括整个或部分外显子缺失、整个或部分内含子保留、多个外显子缺失等。异常剪接的结果可能会造成外显子部分序列缺失，从而导致蛋白缺失长片段氨基酸；也可能出现非3倍数的插入或缺失，导致移码突变或产生终止信号，并最终导致正常蛋白功能的缺失。

通过测序，我们可获得大量的SNP突变位点。有些位点位于基因非编码区，如内含子、启动子、基因间隔区等，有些位点位于临近内含子和外显子交界处，我们可以挑选这些位点进行生信分析，筛选出可能与可变剪接相关的突变位点。

传统的生信分析预测工具，是以经典的剪接模型作为标准，进行筛选。但是可变剪接的机制是精密且复杂的，所以传统的生信分析算法无法准确模拟实际的剪接情况，常常会遗漏较多的致病位点。

通过大数据分析的AI预测模型则可以解决这个问题。我们可以结合传统的生信分析和AI模型对我们的位点进行筛选，候选出我们感兴趣的位点，再开展下一步的验证实验。罕见病数据中心（RDDC）的AI工具可以进行RNA剪接预测。通过AI神经网络模型和生信数据算法逻辑进行处理，通过分析碱基突变中对蛋白编码翻译影响较大的剪切异常，得出碱基突变中真正导致基因疾病的最准确的原因。简单来说，只需要输入目的基因、转录本ID、突变位点位置和突变类型，即可得到预测结果。

常规的验证思路是构建点突变细胞系，然后通过细胞表型分析和cDNA检测等方法验证异常可变剪接的猜想。但是当突变位点数量较多时，构建点突变细胞的时间和成本会提高。所以在这之前，先通过便捷的Minigene系统验证，则会大大提高成功率。

Minigene是在体外将含有突变位点或野生型位点的外显子及旁侧内含子克隆至载体上，然后将载体转染至细胞中，接着通过RT-PCR和测序，分析剪切的情况。大致工作原理是：克隆位点处可以装载待研究的外源外显子及旁侧内含子，在克隆位点上下游分别存在载体自带的外显子A和B。并且已经根据外显子A和B序列设计了RT-PCR的扩增引物，用于后续的检测。将构建好的载体转染到细胞中，野生型组会表达出含有外显子A+外源外显子+外显子B的mRNA。通过RT-PCR及测序就能知道其基因型。如果突变组可以产生异常的可变剪接，则表达出与野生型不一致的mRNA。

图 1 利用Minigene系统体外验证异常可变剪接流程

Minigene已经被广泛应用于异常剪接的研究。有研究者通过家系分析及测序发现EYS存在变异位点（图2），并且可能与遗传性视网膜变性发生相关。通过生信分析，他们发现有两次突变位点可能影响可变剪接，分别是: c.3877+1G>A和c.2992_2992+6delinsTG。

接下来，他们利用Minigene系统，验证了预测结果：第一个位点c.3877+1G>A，将24号内含子、25号外显子和25号内含子装载至pSPL3载体中，转染ARPE-19细胞系，通过RT-PCR扩增及测序发现该位点可以产生异常可变剪接（图3）。

另外一个位点也是以相同的方法验证：将18号内含子、19号外显子和19号内含子装载至pSPL3载体中，分别转染HEK293T和ARPE-19细胞系，通过RT-PCR扩增及测序发现该位点可以产生异常异常可变剪接（图3）。

图 2 EYS存在多个变异位点可能与色素性视网膜炎发生有关

图 3 Minigene系统验证异常可变剪切的发生

mRNA的异常剪接与疾病发生密切相关，通过研究其发生机制对于相关药物的开发非常必要，但也有较多的困难需要克服。最为棘手的是在通过测序等手段获得大量变异位点时如何高效、准确地筛选出可能的致病位点，并科学地展开验证是非常关键的。为了避免做无用功，使用生信及AI预测可变剪接的发生，是高效且准确的途径。再经过低成本、便捷和准确的Minigene系统验证，就可以确定突变位点的作用效应。