关于基因编辑细胞，看这篇就够了

相信在科研上默默努力的小伙伴一定听过或被安利过CRISPR-Cas基因编辑技术，小编在初次了解到这个技术时，感觉它太强大了！特别是在基因功能研究中，常常会用到CRISPR-Cas技术，例如构建基因敲除、基因定点突变和基因敲入的细胞等，方便和高效的标签已经牢牢贴在它的身上。今天带大家一起回顾CRISPR-Cas在细胞实验上的帮助吧！

基因敲除（Knock out，KO）是基因功能研究中的“减法”套路，也就是基因功能缺失的研究思路，当目的基因被敲除，基因功能丧失后，所出现的细胞表型变化我们便认为与该基因相关。同时，这个“减法”套路可以用RNAi技术在转录水平上实现，但RNAi技术的调控原理是靶向mRNA，与CRISPR-Cas技术的KO在效果上存在差异。那么，下面给大家回顾一下整个敲除实验的流程和注意细节！

首先，使用CRISPR-Cas进行敲除基因有两种策略——移码敲除和片段敲除。两种策略各有优缺点，需根据敲除细胞的类型和目的基因信息来综合选择。

设计合理有效的sgRNA是我们最终成功实现基因编辑的重要前提。这里需要注意的是要尽可能选择切割效率高效和特异性好的sgRNA，避免影响其他基因和脱靶等情况。

获取sgRNA后，我们需要将其和Cas转导到细胞内，常用的方法有RNP法、质粒法和慢病毒法。三种方法都各具特点，RNP法简便、快捷和敲除效率较好；慢病毒法的敲除效率高，但存在影响其它基因和脱靶的风险；质粒法方便、简易，但效率较低。

编辑过后的混合细胞池存在各种细胞类型，可通过稀释等方法获得单克隆细胞，然后再通过PCR和测序鉴定基因型，筛选目标基因型的单克隆。如果使用片段敲除的策略（敲除200bp以上），可通过PCR扩增敲除片段附近的区域，通过比较与野生型的电泳结果，能直观地知道敲除结果。当然也需要对扩增的PCR产物进行测序，进一步明确基因型。如果是移码突变策略，则需要扩增靶区域进行测序，明确基因型。

CRISPR-Cas技术也可进行细胞的基因定点突变和敲入。在sgRNA和Cas蛋白的基础上引入带有目的片段的Donor模板，启动细胞的同源重组修复机制，达到基因点突变或基因敲入。在开展实验时，需要注意的环节是sgRNA的设计、Donor模板的设计、细胞类型与生长状态和瞬转电压等。

在开展点突变实验时，除了上述的方法外，还能使用以CRISPR-Cas系统为基础的单碱基编辑器。单碱基编辑器包含sgRNA和融合蛋白两个部分。其中融合蛋白是由切割基因组能力大大降低的突变型Cas（dead Cas，dCas或nickase Cas，nCas）和促碱基转换的分子融合而成。在sgRNA引导下，融合蛋白到特定的基因组位置上编辑指定的碱基。

CRISPR-Cas系统具有高效、精准和方便等特点，在经过不断开发和改进，已经进化出多个应用于不同场景的版本，为我们的实验提供了极大的助力。各位同学根据实验需求，科学运用CRISPR-Cas系统，注意实验细节，相信肯定能取得好的实验结果。