在基因转录过程中，外显子和内含子都会被复制到前体信使RNA（pre-mRNA）中，随后通过剪接去除内含子，获得编码序列，最终翻译成蛋白质。随着全基因组测序的发展，人们逐渐认识到内含子突变在多种疾病，尤其是罕见病中，具有重要作用。研究表明，约10%-30%的疾病相关基因突变（主要为内含子突变）会影响剪接或通过调控元件（如增强子和沉默子）的失调，引发隐性剪接位点激活、假外显子包含和外显子跳跃等机制，最终导致疾病。这些机制通常会产生提前终止密码子（PTC），引发无义介导的RNA降解（NMD）、蛋白质二级结构改变或基因/蛋白表达水平失调[1-3]。今天为大家介绍的家族性自主神经功能障碍研究模型，即是由内含子突变引发的典型疾病案例。
图1 内含子突变对Pre-mRNA剪接的常见影响类型[3]
家族性自主神经功能障碍（FD）与ELP基因内含子突变
家族性自主神经功能障碍（FD）是一种罕见的遗传性神经系统疾病，由神经元发育受损和中枢神经系统退化引起。患者因自主神经系统和感觉神经系统的缺陷，表现出多汗、间歇性高血压、流涎、吞咽困难、大小便失常、呼吸困难及周期性呕吐等症状。该病具有种族特异性，主要影响德系犹太人，在该人群中的发病率约为1/3600，仅约50%的患者能存活至40岁[4-5]。ELP1（IKBKAP）基因编码延伸复合物组成部分，在神经元的发育和功能中发挥重要作用。几乎所有FD患者都携带ELP1基因双拷贝突变，其中超过99%为第20号内含子5'剪接位点突变（IVS20+6T>C）。该突变破坏了U1小核核糖核蛋白与第20号内含子供体剪接位点的碱基配对，导致第20号外显子跳跃[4-6]。这种错误剪接导致转录本框架移位，产生提前终止密码子（PTC），从而翻译出截短的ELP蛋白，最终导致神经元损伤和死亡。
图2 ELP1/IKBKAP内含子突变IVS20+6T>C导致转录本剪接异常的机制[6]
靶向ELP1的FD疗法及相关动物模型
目前，FD尚无根治方法，治疗策略主要集中在对症治疗和支持性护理，以缓解症状并预防并发症。由于IVS20+6T>C突变是FD最常见的致病突变，研究的重点在于纠正该突变引起的错误剪接模式，以生成全长ELP1蛋白。冷泉港实验室和PTC Therapeutics的研究人员在这一领域开展了诸多研究，包括反义寡核苷酸（ASO）和小分子药物的开发[7-9]。研究表明，使用野生型小鼠研究内含子突变ELP1基因的剪接模式不可行，而纯合Elp1基因敲除小鼠会在胚胎期死亡。表达带有人源突变ELP1基因的转基因小鼠由于正常水平的内源性小鼠Elp1基因表达，未表现出明显的疾病表型，因此需要结合小鼠内源性Elp1基因单拷贝敲除，但这仍存在转基因拷贝不稳定和表型不一致等问题[10-12]。此外，由于小鼠和人类基因剪接模式的差异，将小鼠Elp1基因第20号外显子及其两侧内含子人源化并引入IVS20+6T>C突变，同样未能产生表型[13]。
图3 通过小分子药物调控IKBKAP IVS20+6T>C第20号外显子剪接模式[9]
以上研究表明，在小鼠体内研究ELP1基因剪接模式可能需要更长甚至全长人类ELP1基因序列。针对这一需求，赛业生物研发了小鼠Elp1基因人源化的B6-hELP1模型（产品编号：I001203），其中小鼠Elp1基因从起始密码子到终止密码子的序列被原位替换为人源ELP1基因的对应序列。此外，在此基础上还构建了IVS20+6T>C人源化疾病模型，以满足广大科研人员在FD研究中的需求。
B6-hELP1小鼠成功表达人源ELP1基因
检测结果表明，在B6-hELP1小鼠的大脑皮层、肾脏、肝脏、骨骼肌和心脏中均存在人源ELP1基因的显著表达，且不存在鼠源Elp1基因的表达。
图4 B6-hELP1小鼠和野生型小鼠体内人源ELP1基因和鼠源Elp1基因的表达
总 结
目前FD治疗研究主要集中在纠正突变引起的错误剪接模式，以生成全长ELP1蛋白。B6-hELP1模型（产品编号：I001203）在小鼠体内表达全长的人源ELP1基因，并且不存在小鼠内源性Elp1基因的干扰，可用于FD研究。根据前期研究，基于B6-hELP1小鼠构建的B6-hELP1 IVS20+6T>C人源化点突变模型（在研）预计将出现与人类FD相似的表型。
参考文献：
[1]Jaganathan K, Kyriazopoulou Panagiotopoulou S, McRae JF, Darbandi SF, Knowles D, Li YI, Kosmicki JA, Arbelaez J, Cui W, Schwartz GB, Chow ED, Kanterakis E, Gao H, Kia A, Batzoglou S, Sanders SJ, Farh KK. Predicting Splicing from Primary Sequence with Deep Learning. Cell. 2019 Jan 24;176(3):535-548.e24.
[2]Chiang HL, Chen YT, Su JY, Lin HN, Yu CA, Hung YJ, Wang YL, Huang YT, Lin CL. Mechanism and modeling of human disease-associated near-exon intronic variants that perturb RNA splicing. Nat Struct Mol Biol. 2022 Nov;29(11):1043-1055.
[3]Lord J, Baralle D. Splicing in the Diagnosis of Rare Disease: Advances and Challenges. Front Genet. 2021 Jul 1;12:689892.
[4]Rubin BY, Anderson SL. IKBKAP/ELP1 gene mutations: mechanisms of familial dysautonomia and gene-targeting therapies. Appl Clin Genet. 2017 Dec 15;10:95-103.
[5]Dietrich P, Dragatsis I. Familial Dysautonomia: Mechanisms and Models. Genet Mol Biol. 2016 Oct-Dec;39(4):497-514. doi: 10.1590/1678-4685-GMB-2015-0335. Epub 2016 Aug 4.
[6]Rubin BY, Anderson SL. The molecular basis of familial dysautonomia: overview, new discoveries and implications for directed therapies. Neuromolecular Med. 2008;10(3):148-56.
[7]Morini E, Gao D, Montgomery CM, Salani M, Mazzasette C, Krussig TA, Swain B, Dietrich P, Narasimhan J, Gabbeta V, Dakka A, Hedrick J, Zhao X, Weetall M, Naryshkin NA, Wojtkiewicz GG, Ko CP, Talkowski ME, Dragatsis I, Slaugenhaupt SA. ELP1 Splicing Correction Reverses Proprioceptive Sensory Loss in Familial Dysautonomia. Am J Hum Genet. 2019 Apr 4;104(4):638-650.
[8]Sinha R, Kim YJ, Nomakuchi T, Sahashi K, Hua Y, Rigo F, Bennett CF, Krainer AR. Antisense oligonucleotides correct the familial dysautonomia splicing defect in IKBKAP transgenic mice. Nucleic Acids Res. 2018 Jun 1;46(10):4833-4844.
[9]Ajiro M, Awaya T, Kim YJ, Iida K, Denawa M, Tanaka N, Kurosawa R, Matsushima S, Shibata S, Sakamoto T, Studer L, Krainer AR, Hagiwara M. Therapeutic manipulation of IKBKAP mis-splicing with a small molecule to cure familial dysautonomia. Nat Commun. 2021 Jul 23;12(1):4507.
[10]Dietrich P, Yue J, E S, Dragatsis I. Deletion of exon 20 of the Familial Dysautonomia gene Ikbkap in mice causes developmental delay, cardiovascular defects, and early embryonic lethality. PLoS One. 2011;6(10):e27015.
[11]Hims MM, Shetty RS, Pickel J, Mull J, Leyne M, Liu L, Gusella JF, Slaugenhaupt SA. A humanized IKBKAP transgenic mouse models a tissue-specific human splicing defect. Genomics. 2007 Sep;90(3):389-96.
[12]Morini E, Dietrich P, Salani M, Downs HM, Wojtkiewicz GR, Alli S, Brenner A, Nilbratt M, LeClair JW, Oaklander AL, Slaugenhaupt SA, Dragatsis I. Sensory and autonomic deficits in a new humanized mouse model of familial dysautonomia. Hum Mol Genet. 2016 Mar 15;25(6):1116-28.
[13]Bochner R, Ziv Y, Zeevi D, Donyo M, Abraham L, Ashery-Padan R, Ast G. Phosphatidylserine increases IKBKAP levels in a humanized knock-in IKBKAP mouse model. Hum Mol Genet. 2013 Jul 15;22(14):2785-94.
