自身免疫性肝炎（AIH）是一种免疫介导的慢性肝病，由免疫系统攻击肝细胞引起，其特点是血清转氨酶水平升高、IgG水平升高和界面性肝炎。之前的研究发现，基于利妥昔单抗（CD20抗体）的B细胞清除疗法是一种有效策略，适用于对标准疗法无应答的患者。
这种疾病由T细胞介导，其中抗原激活的CD4+和CD8+ T细胞作为效应细胞分化和增殖。B细胞也被认为参与了自身免疫，具体途径是抗原呈递、产生自身抗体和细胞因子。然而，确切的分子机制至今仍未阐明，这可能是因为缺乏合适的AIH模型。
日本庆应义塾大学医学院的研究人员近日利用腺相关病毒（AAV）IL-12模型，再现了自身反应性B细胞相关的AIH病理学的重要特征。他们成功鉴定了脾脏B细胞与细胞毒性CD8+ T细胞之间的相互作用。这项研究成果发表在《JHEP Reports》杂志上。
图片来源：《JHEP Reports》
（https://doi.org/10.1016/j.jhepr.2023.100757）
研究材料与方法
在这项研究中，研究人员在赛业生物的协助下构建了实验性AIH模型，通过AAV载体在肝脏中过表达IL-12触发细胞毒性T细胞的扩增，重现AIH患者的临床特征。他们利用CD20抗体和B细胞过继转移验证了脾脏B细胞的致病作用，并通过RNA测序分析发现了IL-15的表达上调。他们还通过流式细胞术等分析确认了脾脏B细胞与细胞毒性T细胞之间的相互作用。
技术路线
01 构建实验性AIH模型，利用CD20抗体和过继转移分析脾脏B细胞的作用
02 通过RNA测序分析发现B细胞中的IL-15表达上调，并验证肝炎发展是否依赖于IL-15
03 分析脾脏B细胞与CD8+ T细胞之间的相互作用及背后的分子机制
04 利用AIH患者的样本验证以上结果，以探索其转化潜力
研究结果
1 实验性AIH模型的构建
研究人员构建了pAAV IL-12质粒载体，并进行了AAV病毒包装，然后他们将AAV IL-12注射到小鼠体内，并观察给药1-8周后的病理变化，以确定实验性AIH（eAIH）模型的适当终点（其中AAV病毒包装服务由赛业生物提供）。他们在4周内观察到血清谷丙转氨酶（ALT）、IgG、抗核抗体水平升高以及界面性肝炎增加，且ALT和AST（谷草转氨酶）在4周时达到峰值。因此，他们在第4周开展了病理学分析，发现小鼠肝脏和脾脏中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的数量增加，其他特征也与AIH患者一致。这些结果表明，AAV IL-12模型适用于探索AIH病理学中的相关机制。
2 B细胞通过扩增CD8+ T细胞加重了eAIH
以往的研究显示，利用CD20抗体清除B细胞对难治性AIH患者有效果。于是，研究人员也在AAV IL-12模型中研究了CD20抗体对肝炎的疗效。CD20抗体治疗导致肝脏和脾脏中的B细胞减少，肝炎在部分程度上改善。值得注意的是，他们观察到血清IgG水平下降。CD20抗体治疗降低了记忆性T细胞的数量，但不影响肝髓系细胞的数量。这些结果表明，B细胞在肝炎的发展过程中起着致病作用。
由于脾脏中的B细胞丰度很高，研究人员推测该器官中的B细胞尤其具有致病作用。为了弄清这一点，他们从注射了AAV IL-12的小鼠脾脏中分离出B细胞，将其过继转移至脾切除小鼠体内（图1）。虽然脾切除术降低了ALT水平，但致病性B细胞的过继转移会逆转这种改善。肝组织学和肝颗粒酶B+CD8+ T细胞的数量表现出类似的趋势，而肝CD4+ T细胞的数量没有变化。由此可见，脾脏B细胞通过扩增CD8+ T细胞（CTL）在肝炎的发展过程中发挥作用。
图1 致病性B细胞的过继转移加重了脾切除小鼠的肝炎[1]
3 致病性B细胞中的IL-15表达增加
之后，通过RNA测序分析，研究人员发现致病性B细胞中IL-15的表达显著上调。IL-15是一种众所周知的细胞因子，促进记忆性CD8+ T细胞和CTL的维持和增殖。因此，他们推测B细胞来源的IL-15在诱导CTL及eAIH的后续发展中起关键作用。在小鼠脾脏中，B细胞大约占表达IL-15的免疫细胞的55%。在eAIH小鼠的肝脏/脾脏CD4+和CD8+ T细胞中，IL-15受体的表达升高，表明对IL-15信号传导更加敏感。此外，他们还观察到，eAIH小鼠脾脏中的B220+ B细胞和CD8+ T细胞彼此相邻，这表明它们之间存在直接的相互作用。
为了验证CTL增殖和肝炎发展是否依赖于IL-15，他们通过体内实验研究了IL-15中和的效果。与预期一致，在注射IL-15抗体后，小鼠的血清ALT水平显著降低，脾细胞数量减少，而肝脏单核细胞（LMNC）不受影响，表明IL-15抗体对脾脏的作用更强。同样地，脾脏和肝脏中的总CD8+ T细胞和颗粒酶B+ CD8+ T细胞数量也减少，表明IL-15中和可抑制脾脏和肝脏CTL，从而改善肝炎。
4 IL-15+ B细胞与CD40L+CD8+ T细胞相互作用
为了验证B细胞与CD8+ T细胞之间的相互作用，研究人员将来自eAIH小鼠的脾脏CD8+ T细胞与分离自eAIH或对照小鼠的脾脏B细胞进行共培养。他们发现，与致病性B细胞的共培养可诱导CD44+CD8+ T细胞的增殖，而对照B细胞则不能（图2）。值得注意的是，IL-15的中和抑制了CD44+CD8+ T细胞的增殖。这些结果表明，来源于脾脏B细胞的IL-15促进了记忆性CD8+ T细胞的增殖和维持。
那么，B细胞中的IL-15是如何上调的？后续的分析发现，IFN-γ和CD40抗体的联合刺激可上调小鼠脾脏B细胞中Il15、Cxcl10和Csf1的基因表达，这表明CD40L+细胞在诱导IL-15+ B细胞的过程中发挥重要作用（图2）。流式分析表明，eAIH中的脾脏CD8+ T细胞表现出CD40L表达上调。这些结果共同表明，脾脏IL-15+ B细胞和CD40L+ CD8+ T细胞相互作用以获得病理功能。
图2 IL-15+ B细胞与CD40L+CD8+ T细胞相互作用[1]
研究人员假设，记忆性CD8+ T细胞和CTL在脾脏B细胞诱导下增殖，随后迁移到肝脏造成肝细胞损伤。他们发现，在发炎肝脏的CD8+ T细胞中，趋化因子受体CXCR3的表达明显增加。CXCR3配体在肝脏中的基因表达也增加，其中Cxcl9的上调最为显著。CXCL9的中和可改善eAIH。CXCL9抗体治疗明显降低了肝脏颗粒酶B+ CD8+ T细胞和IL-15Ra+ CXCR3+ CD8+ T细胞的数量，表明CXCL9/CXCR3轴在肝炎发展中起着关键作用。
5 AIH患者血液中的IL-15+ B细胞增加
最后，为了探索这些结果的转化潜力，研究人员还分析了患者的临床样本。他们发现，AIH患者血清中存在高浓度的IL-15和IL-15+ B细胞，并与ALT水平呈正相关。此外，他们还观察到CD40L+IL-15Ra+记忆性T细胞的诱导，表明在AIH患者中存在与IL-15+ B细胞的相互作用。这些结果支持在AIH患者中进行转化研究和靶向治疗。
研究结论
图3 脾脏IL-15+ B细胞在AIH发展中发挥致病作用[1]
这项研究利用实验性AIH模型再现了人类AIH的临床特征。通过这个模型，他们发现IL-15和CD40L对脾脏中B细胞与CD8+ T细胞之间的相互作用是不可缺少的，这种互作导致CD8+ T细胞局部扩增，并通过CXCL9/CXCR3轴迁移到肝脏，导致AIH发生。体外和体内分析证实了B细胞在AIH中的致病作用（图3）。研究人员认为，对致病性B细胞的进一步研究有望催生CD20抗体治疗之外的新型治疗方法。
参考文献：
[1]Fujimori S, Chu PS, Teratani T, et al. IL-15-producing splenic B cells play pathogenic roles in the development of autoimmune hepatitis. JHEP Rep. 2023 Apr 7;5(7):100757. https://doi.org/10.1016/j.jhepr.2023.100757
