研究人员发现，在缺氧条件下培养Mtb H37Rv菌株时，培养滤液中的D-丝氨酸水平显著增加，而L-丝氨酸没有增加。蛋白质组学分析显示，Mtb磷酸丝氨酸氨基转移酶Rv0884c（SerC）的蛋白水平在缺氧条件下升高。在敲降Rv0884c后，缺氧诱导的D-丝氨酸分泌增加被显著下调。在小鼠感染H37Rv后，肺组织和血清中的D-丝氨酸（而非L-丝氨酸）水平显著升高，但敲降Rv0884c可以显著降低D-丝氨酸的水平。这些结果表明，Mtb在缺氧条件下诱导Rv0884c表达，使得D-丝氨酸水平升高。

在缺氧条件下，敲降Rv0884c会促进H37Rv菌株的体外生长，而D-丝氨酸的补充则抑制其生长。与感染Rv0884c敲降菌株或突变菌株的小鼠相比，感染Rv0884c敲降菌株并补充Rv0884c的小鼠的病理状况更严重，肺组织中的细菌负荷明显更高。同样地，用D-丝氨酸处理受Mtb感染的小鼠会导致更严重的病理状况和更高的细菌负荷，说明D-丝氨酸损害了小鼠的抗结核免疫。

Mtb主要抵抗和损害巨噬细胞的多种防御功能。于是，研究人员分析了D-丝氨酸是否影响Mtb在巨噬细胞中的存活。他们发现，添加D-丝氨酸并没有显著改变Mtb H37Rv在BMDM中的存活率。同样，ATc诱导的Rv0884c敲降也没有显著改变Mtb H37Rv的存活率（图1）。

那么，D-丝氨酸的体内影响是否依赖CD8+ T细胞？为了验证这一假设，他们将WT小鼠的CD8+ T细胞转移到Rag1^-/-小鼠（缺乏T细胞和B细胞，由赛业生物提供）中，用Rv0884c敲降菌株感染这些动物，并在部分小鼠体内注射D-丝氨酸。对于转移了CD8+ T细胞的Rag1^-/-小鼠，Rv0884c敲降可减少小鼠肺组织中的细菌量，而添加D-丝氨酸可增加细菌量（图1）。这些结果表明，尽管D-丝氨酸对巨噬细胞的抗菌活性没有直接影响，但它能抑制CD8+ T细胞的反应。

接着，研究人员分析了D-丝氨酸是否会损害CD8+ T细胞的效应功能。他们采用了T细胞与巨噬细胞共培养的体外模型，其中TB10Rg3 T细胞来源于表达TB10Rg3 TCR的基因敲入小鼠（与赛业生物合作建立），能够特异性识别Mtb的B10.4_4–11表位。

他们发现，D-丝氨酸能够显著抑制TB10Rg3 T细胞释放IFN-γ。经D-丝氨酸处理后，TB10Rg3 T细胞限制Mtb细胞内生长的能力减弱（图1）。在Mtb H37Rv感染后，经D-丝氨酸处理的小鼠肺组织中产生IFN-γ的CD8+ T细胞比例显著低于对照小鼠。这些数据表明，D-丝氨酸通过抑制CD8+ T细胞产生IFN-γ而间接降低了巨噬细胞限制Mtb的能力。

图1 D-丝氨酸抑制CD8+ T细胞产生IFN-γ^[1]

为了证明Mtb在感染过程中产生的D-丝氨酸与外源性D-丝氨酸有相同的作用，研究人员利用Rv0884c敲降或补充菌株开展了上述实验。与对照组相比，当TB10Rg3 T细胞与感染了Rv0884c表达菌株的BMDM共培养时，TB10Rg3 T细胞产生的IFN-γ减少。在小鼠感染Rv0884c敲除菌株之后，肺组织中产生IFN-γ的CD8+ T细胞比例增加，但D-丝氨酸处理逆转了这种增加。

为了证实IFN-γ参与了CD8+ T细胞对巨噬细胞内Mtb的限制，他们还分析了BMDM和Cd4^CreIfng^fl/fl小鼠（Cd4-Cre小鼠与Ifng-CKO小鼠由赛业生物提供）的细菌负荷，这种小鼠产生了IFN-γ^-/- CD8+ T细胞。当BMDM与IFN-γ^-/- CD8+ T细胞共培养时，感染Rv0884c敲降菌株后的细菌负荷没有明显低于野生菌株。同样地，敲降Rv0884c并不能导致Cd4^CreIfng^fl/fl小鼠肺组织中的细菌负荷或病理状况减少，说明Rv0884c可能通过下调CD8+ T细胞产生的IFN-γ来抑制宿主免疫。

CD8+ T细胞的IFN-γ转录受两个关键转录因子T-bet和Eomes的调控。在分析D-丝氨酸影响IFN-γ表达的机制时，研究人员发现D-丝氨酸的处理可明显抑制体外CD8+ T细胞中T-bet的表达。在体内，与感染对照菌株的小鼠相比，感染Rv0884c敲降菌株的小鼠肺组织中T-bet+ CD8+ T细胞的比例明显更高，而D-丝氨酸处理可逆转这一现象（图2）。

在CD8+ T细胞中，T-bet是通过STAT-1、STAT-4和mTOR信号通路诱导的。后续的分析表明，D-丝氨酸处理导致mTORC1通路激活明显减少。在体外分化模型中，用雷帕霉素（mTORC1抑制剂）处理T细胞可显著抑制CD8+IFN-γ+ T细胞和T-bet+ CD8+ T细胞的比例，并消除D-丝氨酸对T-bet和IFN-γ表达的抑制作用（图2）。这些结果显示D-丝氨酸可能会抑制CD8+ T细胞中mTORC1的活化。

图2 Rv0884c/D-丝氨酸通过mTORC1失活来抑制CD8+ T细胞产生IFN-γ^[1]

研究人员在进一步分析后发现，D-丝氨酸直接与GATOR2复合物的亚基之一WDR24相互作用，而GATOR2是维持mTORC1活化的重要调控因子。在内源性条件下，WDR24与另一亚基SEC13相互作用，而D-丝氨酸的处理会减弱WDR24与SEC13的相互作用。敲降WDR24消除了D-丝氨酸对S6磷酸化以及对T-bet和IFN-γ表达的抑制作用。WT小鼠在感染Rv0884c敲降菌株后的细菌负荷减少在CD4^CreWDR24^fl/fl小鼠（Cd4-Cre小鼠与WDR24-CKO小鼠由赛业生物提供）身上也没有观察到。由此可见，D-丝氨酸可能直接与WDR24相互作用，破坏GATOR2复合物的形成，并抑制mTORC1的活性和CD8+ T细胞对Mtb的限制。

图3 研究示意图^[1]

总的来说，这项研究表明，结核分枝杆菌在进化过程中通过增强D-氨基酸的合成，将适应缺氧与抑制CD8+ T细胞反应结合起来，从而促进了分枝杆菌在巨噬细胞的缺氧和免疫敌对环境中生存（图3）。研究人员下一步将分析分枝杆菌的代谢物是否会抑制其他适应性免疫细胞，以及消除抑制作用是否能提高结核病疫苗的效力。

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