基因组完整性的保持对抑制肿瘤至关重要。DNA修复基因的突变会导致基因组不稳定性及癌症易感性增加。另一方面，顺铂等化疗药物会对癌细胞造成不可修复的DNA损伤。部分药物会导致DNA加合物的形成，干扰正常的DNA复制。在复制叉停滞后，一种重启机制是由引发酶-聚合酶PRIMPOL在损伤下游重新启动，从而在新生链上留下单链DNA（ssDNA）缺口，留待日后填补。
近年来，新生链上的ssDNA缺口再次引发了人们的关注，因为多项研究证明它们的积累与癌细胞对顺铂或PARP抑制剂等化疗药物的敏感性有关。ssDNA缺口逐渐形成细胞毒性，但具体过程仍不清楚。不过，人们最近发现了几种缺口填补机制，可能会抑制这种细胞毒性。一种是BRCA介导的同源修复，另一种是通过专门的跨损伤合成（TLS）聚合酶来填补，但这些事件是如何调控的，目前仍知之甚少。
宾夕法尼亚州立大学医学院的研究人员近日发现，单ADP核糖基转移酶PARP10在ssDNA缺口填补过程中发挥重要调节作用，能促进BRCA缺陷细胞的基因组稳定性。这项研究成果于2024年7月23日发表在《Nature Communications》杂志上，为BRCA突变肿瘤的治疗揭开了潜在的新靶点。
研究材料与方法
在这项研究中，研究人员主要使用PARP10和RAD18敲除细胞系来了解其功能，其中使用了慢病毒构建体（由赛业生物提供）进行重新表达PARP10野生型和突变体。他们利用中性彗星实验和BrdU碱性彗星实验来检测DNA链断裂，并利用S1核酸酶DNA纤维测定法来检测ssDNA缺口。他们还利用基于邻位连接的SIRF分析来定量DNA复制叉上的蛋白质互作。
技术路线
01 评估PARP10缺失对ssDNA缺口形成的影响
02 评估PARP10和RAD18是否存在相互作用，以及PCNA泛素化对ssDNA缺口形成的影响
03 分析缺口填补是否需要PARP10的催化活性及其与PCNA的相互作用
04 评估PARP10和BRCA通路的同时缺失是否会进一步抑制缺口修复
研究结果
1. PARP10缺失会导致ssDNA缺口的积累
首先，研究人员试图分析PARP10缺失对DNA复制过程中ssDNA缺口形成有何影响。作为ADP核糖基转移酶家族中的成员，PARP10能催化底物上单个ADP核糖分子的转移。通过BrdU碱性彗星分析，他们发现在HeLa和DLD1细胞中，PARP10的缺失会导致ssDNA缺口形成的增加。
之后，他们还利用S1核酸酶DNA纤维测定法来特异性检测新生链上的ssDNA缺口。他们发现，PARP10缺失细胞在暴露于羟基脲或顺铂后，新生链上的ssDNA缺口积累。利用PARP10抑制剂（OUL35）处理HeLa细胞也会导致ssDNA缺口的积累，这意味着PARP10在缺口抑制中起作用离不开其催化活性。这些结果表明，PARP10在抑制基因毒性药物诱导的ssDNA缺口积累方面发挥着重要作用。
2. PARP10通过RAD18介导的PCNA泛素化促进了缺口填补
接下来，研究人员分析了PARP10是否在缺口填补中发挥直接作用。他们利用PARP10抗体开展了SIRF分析，发现顺铂处理细胞中的灶形成显著增加，表明在缺口诱导条件下，PARP10被招募到新生DNA上。同样地，用羟基脲处理也会导致PARP10与新生DNA结合（图1）。这些结果显示，PARP10与新生链上的ssDNA缺口结合。
由于RAD18敲除细胞在顺铂处理后也会显示出ssDNA缺口积累，研究人员想看看PARP10和RAD18是否存在相互作用。RAD18是一种E3泛素连接酶，它介导的PCNA泛素化促进了ssDNA缺口的填补。免疫共沉淀实验表明，PARP10与RAD18发生特异性共沉淀（图1）。在邻位连接分析（PLA）中，他们还观察到PARP10-RAD18互作的特异性信号。后续的RAD18 SIRF分析显示，RAD18与新生DNA缺口结合。PARP10的缺失降低了RAD18的信号，表明PARP10促进了新生链缺口上的RAD18招募。
图1 PARP10与新生链缺口结合并促进RAD18的招募[1]
为了验证RAD18的招募会导致PCNA泛素化，研究人员采用SIRF分析来测定ssDNA缺口处的PCNA泛素化。利用特异性检测PCNA泛素化的抗体，他们在羟基脲处理HeLa细胞后观察到SIRF灶。泛素连接酶RAD18的缺失会导致SIRF灶数量减少，而去泛素化酶USP1的缺失会导致数量增加。重要的是，PARP10的缺失、删除或抑制也会导致SIRF灶数量减少，这表明PARP10促进了新生链缺口处的PCNA泛素化。
PCNA泛素化可促进TLS聚合酶的招募，以绕过DNA损伤。最近的研究发现，TLS聚合酶REV1参与了缺口填补。于是，研究人员开展了REV1 SIRF实验。他们发现，在诱导缺口后，REV1与新生DNA结合，而这种结合在PARP10缺失时减少。这些结果表明，PARP10通过增强新生链上的RAD18招募来促进PCNA泛素化，随后促进REV1招募进行缺口填补。
3. PARP10的催化活性及其与PCNA互作是缺口填补所必需的
PARP10的C端存在单ADP核糖基转移酶催化结构域（图2）。在构建催化位点的突变体后，研究人员发现PARP10被招募到新生链ssDNA缺口处离不开其催化活性以及与PCNA的相互作用。BrdU碱性彗星分析和S1核酸酶DNA纤维测定还表明，PARP10与PCNA的互作以及催化活性都是抑制ssDNA缺口所必需的（图2）。后续的分析证实，PARP10直接促进RAD18被招募到停滞的复制叉上，并在PCNA泛素化后促进REV1介导的缺口填补。
图2 PARP10的催化活性及其与PCNA互作是缺口填补所必需的[1]
4. PARP10抑制BRCA缺陷细胞中的ssDNA缺口积累
之前的研究表明，BRCA通路可促进ssDNA缺口的填补。事实上，BRCA1或BRCA2的缺失会导致ssDNA缺口积累增加，与PARP10失活相似。此外，BRCA1或BRCA2的敲低会增加新生DNA上的PARP10招募，表明PARP10介导的缺口填补在BRCA缺失时会增强。
研究人员还发现，在BRCA2敲除的HeLa细胞中，羟基脲和顺铂处理都会增加缺口的形成，而PARP10缺失会加剧这种情况。同时，PARP10敲除的SKOV3细胞在羟基脲处理后表现出缺口形成增加，而BRCA1或BRCA2的缺失进一步加剧了这一点。这些结果表明，PARP10和BRCA通路对应于缺口抑制的不同机制，这两个过程的同时失活会使细胞的缺口修复功能严重受损。
研究结论
图3 ssDNA缺口填补的示意图[1]
这项研究发现PARP10是ssDNA缺口填补的调节因子。在诱导缺口后，PARP10本身会定位在新生DNA上，与RAD18相互作用，并在PCNA泛素化后招募TLS聚合酶REV1进行缺口填补。研究人员认为，在BRCA有功能的细胞中，缺口最终会通过同源修复来填补。在BRCA缺陷型细胞中，这种修复功能受损，而PARP10的进一步缺失会降低TLS介导的缺口填补。因此，BRCA和PARP10同时失活的细胞无法修复缺口（图3）。他们认为，PARP10是治疗BRCA突变肿瘤的潜在靶点。
