铁，是维持人体正常生理功能所必需的微量金属营养元素。例如，在氧气运输、呼吸链电子传递、氧化还原平衡、大分子生物合成等方面，铁起到至关重要的作用。铁代谢失衡会引发多种免疫相关疾病，例如：铁缺失会导致B细胞细胞周期停滞并引发B细胞谱系发育受阻；铁超载则会促进CD4+T细胞病理性扩增，引发红斑狼疮的自身免疫表型。癌症本身也是异常增殖细胞逃避免疫系统监视，免受免疫细胞杀伤和清除的综合性疾病。然而，铁元素，特别是铁代谢，在癌症发生和恶性进展中起到何种作用，在肿瘤微环境中如何调控抗肿瘤免疫，这些科学问题仍然知之甚少。

 

 

最近，上海交通大学医学院附属仁济医院朱鹤研究员团队，发现在前列腺癌微环境中存在一群铁富集的癌相关成纤维细胞，根据英文缩写(Ferrum iron CAFs)作者将其命名为FerroCAF。FerroCAF在PCa中的比例随疾病进展而升高，并通过铁依赖的表观遗传学机制，促进PCa肿瘤免疫抑制。该项研究是继成肌纤维型CAF（myCAF）、免疫调节型CAF（iCAF）、抗原递呈型CAF（apCAF）、衰老型CAF（senCAF）等相继被报道后，我国学者揭示的促癌CAF新亚型：FerroCAF。

 

《Nature Communications》

 

研究材料和方法

作者利用单细胞测序技术（scRNA-seq）、多种前列腺癌(prostate cancer, PCa)转基因小鼠模型、前列腺癌临床组织样本，普鲁士蓝铁染色、连续切片免疫组化和免疫荧光染色、Ferro-Orange胞内铁探针流式检测技术，揭示了铁富集的CAF在包括前列腺癌、肺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中普遍存在。值得一提的是：作者在验证FerroCAF通过分泌髓系细胞相关分泌蛋白（myeloid cell associated secretory protein, MASP）如CXCL1, CCL2, CSF1等募集髓系来源抑制性细胞MDSC、肿瘤相关巨噬细胞TAM等，促进肿瘤免疫抑制的研究中，使用了赛业生物（Cyagen）的C-NKG免疫缺陷型小鼠，并阐明了FerroCAFs发挥免疫抑制效应依赖于免疫细胞的功能。

 

技术路线

 

 

实验结果

1. 新型铁富集CAF在前列腺癌中随疾病进展而富集

图1 新型铁富集CAF在前列腺癌中随疾病进展而富集

 

作者利用scRNA-seq技术对感兴趣的CAF组分进行聚类，发现Cluster-1是唯一一群既随着肿瘤进展（从3月到12月）比例上升，且在两个时间点，占CAF中比例最高的亚群。KEGG分析揭示，Cluster-1有“元素吸收”和“铁死亡”两个关键特征。由于Cluster-1比例随着肿瘤生长而升高，并未发生铁死亡，作者进而从铁代谢的方向入手，通过普鲁士蓝铁染色实验，揭示了在肿瘤组织的基质区域存在一群铁富集的stromal cell。在补充数据中，作者利用连续组织切片，发现这群铁富集的stromal cell表达CAF标志物：PDPN，αSMA，PDGFR，S100A4，Vimentin等，同时不表达上皮Cd326/EpCam，不表达内皮Cd31，不表达免疫Cd45等谱系标记物，因此作者将其命名为铁富集的癌相关成纤维细胞FerroCAF。

 

2. FerroCAF的特异性标记物为Pvr，且分泌MASP细胞因子和炎性因子

 

图2 FerroCAF的特异性标记物为Pvr，且分泌MASP细胞因子和炎性因子

 

 作者利用scRNA-seq分析发现Cluster-1 FerroCAF特异性高表Pvr (poliovirus receptor), 进而用免疫荧光染色等方法验证了Pvr是FerroCAF可靠的特异性细胞表面标记物，并且在小鼠和人类前列腺癌FerroCAF中具有种属保守型。在FerroCAF排名靠前的差异表达基因中，绝大部分是髓系来源抑制性细胞（Myeloid Derived Suppressor Cell, MDSC）和肿瘤相关巨噬细胞（Tumor Associated Macrophage, TAM）相关的细胞因子和炎性因子，作者将其定义为MASP，包括CSF1，CCL2，CCL7，CXCL1，CXCL2等。这提示FerroCAFs可能通过MASP招募MDSC和TAM在肿瘤微环境中大量聚集。作者利用CellChat分析、条件性培养基刺激等实验阐明FerroCAFs和MDSC存在很强的“细胞-细胞通讯”活性，促进髓系细胞高表达Arg1, Il10，Tgfb等免疫抑制性因子。

 

3. FerroCAF铁富集是由Hmox1高表达催化Heme降解释放游离铁导致

 

 

图3 FerroCAF铁富集是由Hmox1高表达催化Heme降解释放游离铁导致

 

作者进而探究了导致FerroCAF铁富集表型的产生机制，研究者发现FerroCAF和其他CAF亚型相比，铁摄取、铁外排、铁储存等相关基因均无显著差异。有趣的是，和铁代谢密切相关的血红素加氧酶Hmox1在FerroCAF中高表达，Hmox1的经典生物学功能在于催化Heme降解，并释放游离铁Fe2+导致铁富集。作者为了验证该假说，利用Hmox1抑制剂（Zn-PP, iHmox1）和Hmox1敲低等方法，发现抑制或下调Hmox1之后，FerroCAF中铁含量显著下降，并且MASP的转录表达也受到显著抑制。

 

4. Hmox1抑制剂能显著抑制MDSC和TAM募集，并促进T细胞浸润和抗肿瘤免疫

 

 

 

图4 Hmox1抑制剂显著抑制MDSC和TAM募集，并促进T细胞浸润

 

作者接着利用同种移植实验将FerroCAF和小鼠PCa细胞混合后，使用了C-NKG免疫缺陷型小鼠（由赛业生物提供）对C57BL/6小鼠（雄性）进行前列腺原位同种移植实验。随机分组后，一组用Hmox1抑制剂Zn-PP（iHmox1）进行给药，另一组则用vehicle作为对照处理。作者在实验终点比较了上述两组小鼠的肿瘤大小、质量、增殖等指标，发现Hmox1抑制剂能显著抑制原位前列腺癌肿瘤生长。作者进而利用流式细胞术分析了肿瘤内MDSC、TAM、T细胞等浸润情况。尽管Hmox1抑制剂并未影响总体免疫细胞浸润，但深刻改变了瘤内免疫细胞的组分：MDSC（包括PMN-MDSC和M-MDSC）和促癌型M2-TAM的数量均显著下调；而抑癌型M1-TAM和Cd8+ T细胞的数量则显著增加。Hmox1抑制剂也促进了T细胞杀伤性相关基因如Gzmb、Ifng等表达。

 

5. FerroCAF中铁富集激活Kdm6b介导的表观遗传重编程启动MASP转录

 

 

图5 FerroCAF铁富集激活Kdm6b介导的表观遗传重编程启动MASP转录表达

 

作者进而探索铁富集的表型如何介导MASP的表达。由于CAF和cancer cell相比，其genetic层面的突变相对较少，其促癌功能的获得更多是由于epigenetic层面改变导致。基于此，作者设想铁富集可能激活了铁依赖的表观遗传学酶功能。为了验证该假说，作者检测FerroCAF中高表达的铁依赖的表观遗传因子，结果发现组蛋白去甲基化酶Kdm6b（催化H3K27me3去甲基化修饰）在FerroCAFs中显著性上调。生化实验验证了Kdm6b在FerroCAF中表达上调，以及H3K27me3修饰在FerroCAFs中水平下调。作者还利用CUT&Tag实验揭示，在Hmox1敲除后(Hmox1-KO)的FerroCAF中，和对照相比，anti-H3K27me3 antibody和DNA结合明显增强，在MASP相关的gene locus，H3K27me3的mark也显著上调。这提示：从Hmox1/iron/Kdm6b信号轴上游敲除Hmox1，能诱发下游Kdm6b活性被抑制，导致MASP基因在内的全基因组H3K27me3修饰增强，导致MASP相关基因转录抑制。

 

 

6. FerroCAF在前列腺癌中富集程度预示较差的临床预后

 

 

图6 FerroCAF在前列腺肿瘤中的富集程度预示着较差的临床预后

 

最后作者利用已发表的临床PCa的单细胞测序数据、TCGA数据等，将FerroCAF的特征性基因（signature genes）：HMOX1、KDM6B、PVR、IL6、CCL2、CSF1、CXCL1等合并为一个基因集，命名为FerroScore用来反映FerroCAF的富集程度。结果显示：作者不仅在其他发表的scRNA-seq数据中找到了FerroCAF亚型的存在，也通过生信分析等手段揭示了FerroCAF的富集预示较高的免疫抑制性特征和较短的患者生存期。研究人员还检测了FerroCAF在其他类型癌症中的存在和临床相关性。令人意外的是，作者通过增强型普鲁士蓝铁染色、生信分析等方法，揭示FerroCAF在临床肺癌样本、卵巢癌样本中均存在HMOX1高表达、铁富集的FerroCAF。和前列腺癌类似，肺癌、卵巢癌中FerroCAF的富集程度中也预示着较高的免疫抑制性特征和较短的生存期。这提示FerroCAF在多种人类恶性肿瘤中广泛存在，也预示通过阻断Hmox1/iron/Kdm6b信号，抑制FerroCAF活性，能激活抗肿瘤免疫活性的广谱可适性。

 

 

图7 阻断Hmox1/iron/Kdm6b信号，抑制FerroCAF活性，进而激活抗肿瘤免疫在多种癌症中具有广谱可适性

 

实验结论

作者在前列腺癌微环境中揭示了一群未被报道的“铁富集的癌相关成纤维细胞（FerroCAF）”，利用生信分析、生化、细胞和动物实验阐明了FerroCAF中铁富集表型是由血红素加氧酶Heme Oxygenase 1 (Hmox1)高表达、催化血红素heme降解导致游离铁释放导致；铁聚集进而激活铁依赖的组蛋白去甲基化酶Kdm6b，后者促进髓系细胞相关分泌蛋白（myeloid cell associated secretory protein, MASP）如CXCL1, CCL2, CSF1等转录表达，募集髓系来源抑制性细胞MDSC、肿瘤相关巨噬细胞TAM等，促进前列腺癌肿瘤免疫抑制。作者明确了Hmox1/iron/Kdm6b信号轴在维持FerroCAF细胞铁富集表型、促肿瘤免疫抑制活性方面的关键作用。基于此，作者提出：通过抑制剂干预Hmox1/iron/Kdm6b信号轴，能有效抑制FerroCAF活性、促进Cd8+T细胞浸润、激活抗肿瘤免疫活性的治疗策略。作者还在其他癌症类型，例如小细胞肺癌、肺腺癌、恶性卵巢癌临床组织样本中也证实了FerroCAF跨癌种存在，也提示阻断FerroCAF免疫抑制活性，激活以前列腺癌为代表的“冷肿瘤”的抗肿瘤免疫活性，具有广谱可适性。