在我们鉴定基因敲除（KO）细胞是否建立成功时，除了基因水平的测序、PCR等方法外，蛋白水平的Western Blot验证也是一个重要的方法。特别是对于文章发表中结果的呈现，Western Blot图尤为重要。

 

但在实际操作的过程中，即使测序鉴定为KO纯合子，但WB实验结果上还是出现了条带，即蛋白残留。基于KO验证特异性抗体库、RNA剪接模型工具、Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统等方面的支持，赛业生物KO细胞定制服务采用“金标准”保证蛋白敲除，致力于帮助大家摆脱实验困扰。

 

蛋白残留是如何产生的

由于目的基因的多转录本引起的蛋白残留

基因一般含有多个不同的转录本，在选择敲除位点时，有时会很难保证覆盖所有的转录本，而未被影响到的转录本就有可能正常转录翻译从而表达出具有部分功能域的蛋白。因此，我们在设计KO细胞方案时，应综合考虑数据库基因信息、文献，甚至通过预实验，从而尽可能地覆盖多个转录本，当然，这就对方案设计的人员有较高的技术和经验要求。

 

由于基因的可变剪切引起的蛋白残留

可变剪切指当某个外显子被破坏或缺失时，其转录的mRNA前体通过不同的剪接方式产生不同的mRNA剪接异构体的过程，是调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制。当我们构建KO细胞时，敲除位点处外显子被切割后，包含在内含子中的RNA剪接规则同时被破坏，在一定情况下，缺失的外显子序列在RNA剪切阶段被略过，直接将其上游的外显子与下游的外显子相连，形成一种全新的mRNA，从而继续蛋白的翻译。

 

外因——Western Blot抗体的选择

Western Blot检测技术是基于抗原抗体的特异性结合的原理，且抗体并不是识别整个目的蛋白，而是识别某段特定氨基酸序列或其中某部分功能结构域，即抗体的特异性。因此，在采用Western Blot检测KO细胞是否存在蛋白残留表达时，如果选择的敲除位点相对靠后，而抗体与蛋白的结合区域若存在于敲除位点之前，便可能会出现抗体与N端残留蛋白的结合，从而导致Western Blot检测条带的出现。不过对于这种情况，目的蛋白的功能很可能已经丧失。

 

赛业生物“金标准”保证蛋白敲除

1.KO验证的特异性抗体库：使用不表达目标蛋白的KO细胞作为阴性对照，确保抗体特异性，乃至实验结果的可重复性，我们拥有全球数量最多的KO抗体验证（4400+种），相关验证数据齐全。

 

2.罕见病数据中心（RDDC）开发的RNA剪接模型工具：预测碱基序列突变后mRNA序列可能发生的剪切情况，辅助筛选ORF移码的单克隆。

3.Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统：方案设计全面专业，优先片段敲除方案、敲除抗体结合位点。

 

4.现货KO细胞库：涵盖肿瘤、心血管、神经等20多种研究领域，启动近2万个全基因组敲除细胞库构建计划。*注：项目需通过风险评估，且在KO验证抗体资源库中匹配到抗体。