外周感觉神经系统在骨稳态维持和骨缺损修复中发挥着至关重要的作用。分布在靶细胞周围的大量神经轴突能够感知骨骼微环境的变化，并分泌神经递质和神经肽。然而，骨缺损往往伴随着促进骨化的神经末梢的缺失，从而限制了诱导骨再生的有效性。因此，确定连接骨骼和神经再生的细胞网络，有助于人们寻找策略来治疗骨缺损。
施旺细胞（SC）是外周神经系统中的原代神经胶质细胞，形成神经轴突外层的髓鞘。在损伤后，施旺细胞通过清除碎片以及刺激髓鞘化和轴突生长来支持外周神经再生。有意思的是，有研究发现施旺细胞能促进骨髓间充质干细胞（BMSC）的骨生成。考虑到施旺细胞在神经再生和骨骼再生中的作用，人们推测它们连接了神经和骨骼修复的微环境。
基于这些背景，上海交通大学医学院附属第九人民医院的研究人员开发出一种自供电的纳米发电机。他们发现，电刺激可以通过驱动施旺细胞的髓鞘化来促进神经再生，进而促进神经依赖性的骨再生。这项研究成果于2024年10月发表在《Nano Today》杂志上，具有临床应用的前景。
研究材料与方法
在这项研究中，研究人员使用了颅骨和股骨缺损大鼠模型。他们利用腺相关病毒（AAV）来特异性清除大鼠体内的髓鞘施旺细胞（mSC），具体过程是给大鼠注射AAV-LSL（由赛业生物提供）和AAV-Cre，给对照大鼠注射AAV-Mpz（由赛业生物提供）和AAV-Cre。他们利用免疫荧光来评估mSC，并利用micro-CT、H&E染色和Masson染色评估骨修复。他们还分析了mSC和巨噬细胞的转录组。
技术路线
利用颅骨和股骨缺损大鼠模型分析mSC在神经再生和骨再生中的作用
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制作自供电的SiO2驻极体复合膜，确定不同膜对神经再生的影响
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通过体外和体内实验分析电刺激和复合膜是否可促进神经再生和骨再生
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通过分析转录组数据等深入剖析mSC介导的神经依赖性骨生成的机制
研究结果
1. 微环境中的mSC连接了骨骼与神经再生
为了研究神经与骨骼再生之间的相互作用，研究人员首先对颅骨和股骨缺损大鼠模型进行了分析。他们发现髓鞘施旺细胞（mSC）聚集在缺损区域周围，具体表现为S100β+ Mpz+细胞数量增加。之后，他们利用腺相关病毒（AAV）来特异性清除大鼠体内的mSC。在注射AAV后，与对照组大鼠相比，mSC耗竭大鼠骨缺损区域周围的CGRP+感觉神经纤维和mSC数量显著减少，表明神经再生受损，并且骨再生能力也下降。这些结果有力支持了mSC在协调骨骼和神经再生中发挥作用。
2. 电刺激和排列整齐的结构通过mSC促进了神经依赖性骨生成
接下来，研究人员探究了利用生物活性材料来调节SC的髓鞘化是否可以诱导骨再生。他们制作了四种不同的膜（图1）：两种是排列整齐的静电纺丝膜，带有或不带SiO2驻极体纳米颗粒（分别为AS膜和AP膜），另两种是排列不整齐的静电纺丝膜，带有或不带SiO2驻极体纳米颗粒（分别为RS膜和RP膜）。他们发现，自供电的SiO2驻极体复合膜（AS和RS膜）可以提供持久的电生理微环境。
图1. 不同膜的制作
为了确定不同膜对神经再生的影响，他们在不同膜上培养了大鼠背根神经节（DRG）外植体。他们发现，神经突在AS膜和AP膜上沿着排列纤维的方向延伸，而在RS膜和RP膜上则是随机延伸（图2）。与AP膜和RP膜上的神经突相比，AS膜和RS膜上神经突的平均长度更长。此外，在AS膜上，他们观察到磷酸化c-Fox表达的诱导和降钙素基因相关肽（CGRP）的分泌，CGRP是一种感觉神经肽，在促进骨再生方面起关键作用，表明DRG神经元受到了强烈刺激（图2）。
之后，研究人员从不同膜上培养的DRG神经元中收集条件培养基，并用来培养骨髓间充质干细胞（BMSC）。与RP膜相比，利用AS膜的条件培养基培养BMSC后，成骨标志物ALP染色更强，ALP活性更高（图2），且促成骨基因的表达也更高。此外，在去除DRG外植体中的内源性mSC后，AS介导的轴突生成和神经依赖性的骨生成明显减弱。这些结果表明，电刺激和排列整齐的结构可通过mSC促进BMSC的骨生成。
图2. AS膜通过刺激SC髓鞘化增强了BMSC的骨生成
研究人员接下来利用颅骨缺损大鼠模型来证明上述结果。与AP膜、RP膜或空白对照相比，用AS膜处理骨缺损会增加三叉神经节的c-Fos表达，表明支配骨的感觉神经被激活。同时，AS膜处理的大鼠有更多新骨形成，骨量和骨体积比值也更高。此外，AS组观察到更多的mSC（S100+、MPZ+）。当mSC被清除或感觉神经支配被系统去除时，AS介导的神经依赖性骨生成显著减弱。大鼠股骨缺损模型也证实了这些结果。
3. AS膜和电刺激促进SC髓鞘化的机制
为了进一步剖析mSC介导的神经依赖性骨生成的机制，研究人员比较了在不同膜上培养的mSC的转录组。他们发现，排列整齐的结构会诱导支持轴突生成的表达程序，而电刺激诱导的差异表达基因与轴突生成、干细胞分化和骨化等通路呈正相关，且网络相关性分析表明，轴突生成相关通路与骨化相关通路存在关联，这表明电刺激诱导的神经修复信号传导促进了骨修复信号传导。后续分析发现，AS处理导致SC中的Notch信号通路明显下调，而在过表达Nicd（Notch胞内结构域）的SC中，AS介导的SC髓鞘化显著降低。因此，他们认为电刺激以及膜上排列整齐的结构通过Notch信号通路促进SC髓鞘化。
众所周知，巨噬细胞也在神经再生微环境中发挥重要作用。于是，研究人员探讨了巨噬细胞是否参与mSC介导的神经依赖性骨生成。免疫荧光分析表明，AS膜上的RAW264.7细胞的CD206信号（M2巨噬细胞标志物）更强。AS降低了促炎细胞因子（IL-6和IL1β）的表达，并增加了抗炎因子（IL-10）的表达。流式分析等进一步证明，在排列整齐的膜上对巨噬细胞进行电刺激可以使细胞极化为M2抗炎表型，而极化的巨噬细胞促进了SC髓鞘化。
结论
图3. 电刺激和排列整齐的结构促进神经再生
这项研究证明了mSC是连接骨骼和神经再生的重要微环境组分。它能够促进神经元的轴突生成和神经肽分泌，并进一步促进神经依赖性骨生成。之后，研究人员制作了一种自供电的驻极体复合膜。他们发现，电刺激和排列整齐的拓扑特征通过抑制Notch信号通路和诱导巨噬细胞向M2表型极化这两种机制促进了mSC的髓鞘化过程，进而有效促进了神经再生（图3）。再生的神经随后促进了骨缺损的修复。这些结果表明，AS膜的使用可以调节mSC活性，有望在临床上作为一种促进骨再生的策略。
原文检索
Sun, Y., Zhang, Y., Guo, Y., Lao, A., Li, D., Lin, K., & Shen, S.G. (2024). A self-powered electret nanogenerator coordinates nerve- and bone-repair microenvironments for bone regeneration. Nano Today. https://doi.org/10.1016/j.nantod.2024.102430
