γδ T细胞是介于固有免疫和获得性免疫系统之间的一种特殊的桥梁细胞，既具有固有免疫细胞特性——大量分布于粘膜/皮肤等频繁接触外界抗原的组织局部、MHC非依赖的抗原识别、无需预先致敏的快速动员和活化；又具有获得性免疫学属性——细胞发育依赖Rag介导的TCR基因VDJ片段重排、TCR介导的抗原识别、具有一定的免疫记忆属性。因此，γδ T细胞在机体发育的早期及多种疾病发生的早期发挥重要的免疫监视、预警和增强αβ T细胞免疫反应的作用。根据产生细胞因子的不同，γδ T细胞可以分为IFN-γ+（γδ T1）和IL-17A+（γδ T17）两个功能亚群；前者具有抗肿瘤、抗胞内病原感染的作用，而后者可以调控组织稳态和起始炎症反应；但是这两个功能亚群分化的分子机理尚未完全解析。
γδ T细胞主要位于免疫监视的第一线，在复杂多变的环境中对mRNA的快速转换有着巨大的需求。m6A甲基化严格调控mRNA的代谢与更新，对mRNA的剪接、运输、翻译和降解均具有重要调节作用，进而控制mRNA周转和基因表达。m6A甲基化是哺乳动物细胞中mRNA中最丰富的修饰，由甲基转移酶复合物（包括METTL3, METTL14, WTAP等）进行添加，并被去甲基化酶（如ALKBH5和FTO）清除。大量研究表明，m6A甲基化在干细胞分化、细胞增殖、精子发生、炎症和肿瘤等许多生理和病理过程中不可或缺。研究发现m6A甲基化也普遍存在于免疫细胞中，并影响固有免疫和获得性免疫。近年来，m6A在CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、调节性T细胞（Tregs）、B细胞、自然杀伤细胞（NK）、巨噬细胞、树突状细胞（DCs）、中性粒细胞和造血干细胞中的作用得到了广泛的研究。然而，METTL3介导的m6A甲基化是否影响γδ T细胞及其亚群分化与功能，仍不清楚。
暨南大学生物医学转化研究院尹芝南教授团队在Cell Reports杂志发表了题为 METTL3-mediated m6A methylation orchestrates mRNA stability and dsRNA contents to equilibrate γδ T1 and γδ T17 cells 的研究论文。该研究利用赛业生物提供的METTL3敲除小鼠揭示了METTL3介导的m6A修饰对γδ T细胞内源性dsRNA的形成和靶向mRNA的降解有显著影响，从而影响γδ T细胞的分化。METTL3缺陷的γδ T细胞产生较少的IL-17，在驱动银屑病的皮肤炎症方面致病性显著降低。
在该工作中，研究人员发现γδ T细胞，尤其是γδ T17亚群，表达高水平的m6A mRNA甲基化关键酶分子METTL3。METTL3的缺失导致γδ T17显著降低，而γδ T1升高。全转录组m6A位点图谱揭示了γδ T17细胞中数千个甲基化修饰的转录本。Stat1是m6a的靶向转录物之一，也是调控T细胞分化的一个众所周知的关键转录因子。m6A缺失延缓了Stat1 mRNA的降解和STAT1蛋白表达增加。m6A的缺失也导致双链RNA（dsRNAs）的形成显著增加，激活dsRNA/IFNs/STAT1通路，进而导致γδ T1升高和γδ T17受损。METTL3缺陷的γδ T细胞在咪喹莫特（IMQ）诱导的银屑病（γδ T17驱动的经典炎症小鼠模型）模型中不能起始炎症反应。这些结果清楚地表明，m6A甲基化调控mRNA的降解和dsRNA的形成，影响γδ T1和γδ T17亚群分化及其介导的屏障免疫反应。有趣的是，METTL3在银屑病患者外周血γδ T细胞中的表达也显著高于正常人，提示该机制可能参与了临床中银屑病的进程。综上所述，该工作发现METTL3介导的m6A甲基化修饰通过调控mRNA代谢和更新，进而控制γδ T细胞的亚群分化与效应功能；解析了γδ T细胞亚群分化的新机制，并为γδ T17细胞介导的炎症反应的诊疗提供了新的理论基础。
研究材料
小鼠C57BL/6J, B6.Cg-Tg(CD2-icre)4Kio/J (Cd2-cre)， B6.129P2-TCRd tm1Mom/J (TCRδ-KO)和C57BL/6-Il17atm1Bcgen/J (IL17A-eGFP)购自杰克逊实验室(Bar Harbor, ME)。C57BL/6N-Mettl3em1cyagen (Mettl3flox/flox)小鼠由赛业生物公司利用基于crispr-cas9的基因组编辑系统构建。将Mettl3flox/flox小鼠与Cd2-cre小鼠杂交获得条件性基因敲除小鼠。本研究中使用的所有小鼠均为性别和年龄匹配的同窝小鼠。每组实验均采用相同性别，所有实验均以两性重复，得到一致的结果。所有小鼠均在暨南大学实验动物中心无特定病原体(SPF)条件下饲养。实验采用6 ~ 8周龄的小鼠，所有操作均遵循暨南大学动物保护与使用委员会批准的伦理学规范和程序。
技术方法
小鼠γδ T细胞的分离和体外培养：
从6-8周龄雄性或雌性小鼠的脾脏和pLN中分离出γδ T细胞。在一些实验中，我们选择了naive (CD44low CD62Lhigh) γδ T细胞。纯化的初代γδ T细胞(培养细胞密度为1×106细胞/ml)在RPMI 1640 GlutaMAX培养基(Gibco, Waltham, USA)加10%牛血清(Gibco)中培养48-72 h，其中含有抗小鼠γδ TCR单克隆抗体(10 μg/ ml)和可溶性抗小鼠CD28单克隆抗体(1 μg/ ml)，用于γδ T17细胞的诱导。
RNA衰变试验：
通过FACS分选纯化γδ T细胞，然后在γδ T17条件下培养。72h后，加入放线菌素D (AAT Bioquest)至终浓度为5 μM，放线菌素D预处理10 min后，分别于t = 0、20、60、80、120 min收获细胞，提取总RNA, RT-qPCR分析。结果用Microsoft Excel处理，然后归一化到t = 0时间点。按照2 -ΔΔCT方法计算表达水平的倍数差异。用ln2/slope计算Stat1 mRNA半衰期(t1/2)。斜率是平均退化。
技术路线
图1。该研究利用赛业生物提供的MRTTL3敲除小鼠探究γδ T细胞产生细胞因子，METTL3缺乏导致gd T17显著降低，gd T1显著升高。
研究结果
(A) C57BL/6J小鼠(n = 8)脾细胞经PMA和离子霉素刺激5 h后，流式细胞术检测γδ T1 (IFN-γ+)、γδ T17 (IL-17+)和γδ T0 (IFN-γ−和IL-17−)细胞中METTL3的表达;(B)免疫印迹METTL3的T细胞的胸腺Mettl3flox /液氧(n = 3)和Mettl3Cd2cre老鼠(n = 3)。(C)定量m6A甲基化的总rnaγδT细胞在脾脏Mettl3flox /液氧(n = 3)和Mettl3Cd2cre老鼠(n = 3)。(D)代表数据IL-17和γ干扰素-γ生产δT细胞从不同的淋巴器官(胸腺、脾脏、周围淋巴结)Mettl3flox /液氧(n = 7)和Mettl3Cd2cre (n = 5)老鼠。(E) Mettl3flox/flox (n = 8)和Mettl3Cd2cre (n = 6)小鼠脾脏γδ T细胞中RORγt, Eomes和T-bet的表达。(F) Mettl3flox/flox (n = 5)和Mettl3Cd2cre (n = 5)小鼠脾脏中Vγ4+ γδ T细胞的IL-17表达的流式细胞术分析。(G和H) Mettl3flox/flox (n = 6 - 8)和Mettl3Cd2cre (n = 6)小鼠皮肤组织中总真皮γδ T细胞(G)或Vγ4−γδ T细胞(H)的IL-17表达的流式细胞术分析。用CD45+ CD11b−CD3+ γδ TCRint预处理皮肤γδ T细胞。(I)从Mettl3flox/flox和Mettl3Cd2cre小鼠的脾脏和外周淋巴结中分选初始γδ T细胞(CD44low CD62Lhigh)，并向γδ T17条件极化8天。流式细胞术分析IFN-γ和IL-17的产生(n = 3)。
图2。METTL3在Stat1转录本上加载m6A以促进降解
(A和B)从Mettl3Cd2cre和Mettl3flox/flox小鼠中分选脾脏γδ T细胞，用于RNA-seq。(A)与Mettl3flox/flox γδ T细胞(n = 3)相比，Mettl3Cd2cre γδ T细胞(n = 3)中富集了差异表达基因的KEGG通路(p值for differences [diff-p-value] < 0.05, log2 fold change [log2FC] > 1)。(B) γδ T17和T1分化相关基因表达的热图。从IL-17A-eGFP小鼠的脾脏和pln中分选出(C-G)初始γδ T细胞，在γδ T17条件下分化9 d。对γδ T17细胞进行m6A-RIP-seq分析。γδ T细胞mRNA长度的m6A位点的宏基因谱(C)。维恩图(D)显示了RNA-seq中差异表达基因的重叠(上和下，差异p值< 0.05)和m6A-RIP-seq中m6a修饰的转录本。热图的502(360 + 142)差异表达基因m6A修改(E)所示。重叠502个差异表达基因受到KEGG通路分析,显示十大通路(F)。综合基因组查看器(进口)跟踪显示m6A-RNA-seq读Stat1基因分布在影射γδT17细胞(G)。(H)流式细胞术分析Stat1表达脾γδT细胞从Mettl3flox /液氧(n = 8)和Mettl3Cd2cre (n = 6)老鼠。三次独立实验的代表性数据。(I)放线菌素d (ActD)处理后，Mettl3Cd2cre和Mettl3flox/flox小鼠γδ T细胞中Stat1 mRNA的降解曲线。剩余的mrna归一化至时间0 min。三个独立实验的代表性数据。
图3。m6A甲基化阻止内源性dsrna的形成，从而激活STAT1
（B)将纯化的γδ T细胞在γδ T17激发条件下刺激30 min，然后检测STAT1的磷酸化水平。流式直方图显示，Mettl3flox/flox小鼠(n = 5)和Mettl3Cd2cre小鼠(n = 4) γδ T细胞中pSTAT1 (Ser727, A)和pSTAT1 (Tyr701, B)的表达。(C) Mettl3Cd2cre脾细胞在γδ T17启动条件下培养4天，检测γδ T细胞产生IL-17和IFN-γ (n = 4)。(D)热图显示Mettl3flox/flox和Mettl3Cd2cre小鼠脾γδ T细胞中dsRNA应答基因的表达。(5)用dsRNA特异性抗体J2免疫荧光法检测Mettl3flox/flox和Mettl3Cd2cre小鼠γδ T细胞中的dsRNA。比例尺，25 μm。(F)流式直方图显示Mettl3flox/flox小鼠(n = 3)和Mettl3Cd2cre小鼠(n = 3) γδ T细胞中J2抗体的平均荧光强度(MFI)，二抗为大鼠单克隆抗小鼠免疫球蛋白G2a (IgG2a)重链(Alexa Fluor 488偶联，克隆SB84a，猫。不。ab172324)。(G和H) Mettl3flox/flox (n = 5)和Mettl3Cd2cre (n = 5)小鼠的脾脏γδ T细胞在γδ T17启动条件下培养4 d，分别加入或不加入TLR3/dsRNA复合物抑制剂(1 μM)。检测γδ T细胞中STAT1的磷酸化(G)和IL-17的产生(H)。
图4。METTL3促进了γδ T17细胞介导的牛皮癣小鼠模型和人的促炎反应
(A) Mettl3flox/flox (n = 8)和Mettl3Cd2cre (n = 5)小鼠每天接受IMQ治疗，连续7天。显示皮屑和he染色切片的代表性图像。比例尺，50 μm。(B)采用real-time PCR检测Mettl3flox/flox (n = 8)和Mettl3Cd2cre (n = 5)小鼠皮肤组织中Il17a、Il17f、Ifng、Il22、Il1b、Il23和Rorc的mRNA水平。(C) IMQ诱导7天后，Mettl3flox/flox (n = 8)和Mettl3Cd2cre (n = 5)小鼠pln和皮肤中γδ T细胞的IL-17和IFN-γ表达的流式细胞术分析。D组和E组小鼠分别移植原代γδ T细胞(每只小鼠移植5 × 105个细胞)和培养的γδ T17细胞(原代γδ T细胞在γδ T17诱导条件下启动;E)将Mettl3flox/flox或Mettl3CD2-cre小鼠的1 × 106个细胞移植到TCRδ-KO小鼠。2 d后，TCRδ-KO受体接受IMQ治疗，每日1次，连续7 d诱导银屑病。显示皮屑和he染色切片的代表性图像。比例尺，200 μm。三次独立实验的代表性数据。(F-H)检测健康对照者(n = 26)和初诊银屑病患者(n = 13)外周血单个核细胞(pbmc)中γδ T或Vδ2细胞中细胞因子(IL-17、IFN-γ)和METTL3的表达。流式细胞仪检测γδ T细胞IL-17和IFN-γ表达情况(F)。流式细胞仪检测γδ T细胞和Vδ2细胞METTL3表达情况(G)。
总结
在本研究中，我们发现γδ T细胞，尤其是γδ T17亚群，高水平表达m6A mRNA甲基化的关键酶METTL3。METTL3缺失导致γδ T17降低，γδ T1升高。转录组全m6A位点图谱揭示了γδ T17细胞中数千个甲基化的转录本。Stat1是m6a的靶向转录物之一，也是调控T细胞分化的一个众所周知的关键转录因子。m6A缺失减少了Stat1 mRNA的降解，导致Stat1表达增加。METTL3的缺失也导致双链rna的形成显著增加，从而激活STAT1，进而导致γδ T1升高和γδ T17受损。与此同时，mettl3缺陷的γδ T细胞在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病(γδ t17驱动的经典炎症小鼠模型)中不能驱动病理。有趣的是，METTL3在银屑病患者外周血γδ T细胞中的表达也显著高于正常人。综上所述，这些结果清楚地表明，m6A甲基化调控mRNA稳定性和双链RNA (dsRNA)含量，以平衡γδ T1和γδ T17细胞。研究结果为γδ T细胞生物学及γδ T17细胞介导的炎症治疗提供了新的思路。
补充说明
Xiao Z, Wang S, Tian Y, et al. METTL3-mediated m6A methylation orchestrates mRNA stability and dsRNA contents to equilibrate γδ T1 and γδ T17 cells[J]. Cell Reports, 2023, 42(7).
