线粒体不仅是细胞的能量工厂，还在细胞代谢、信号传导和死亡中扮演着重要角色。线粒体电子流（Mito-EF）作为呼吸链中支持能量供应的关键组成部分，与肿瘤、炎症和帕金森病等多种疾病的发生机制密切相关。不过尽管Mito-EF在调节线粒体稳态和细胞发育方面发挥重要作用，但由于缺乏专门的工具，它在线粒体质量控制中的直接作用仍不明确。

 

由于电子作为基本粒子，缺乏化学可修饰特征，开发Mito-EF的分子探针颇具挑战性。不过它在线粒体电子传递链中的活性与质子跨线粒体内膜（IMM）转移的速率密切相关，故监测线粒体内膜的质子变化可以反映Mito-EF的活性。然而，目前的质子探针通常定位在细胞器基质内，这限制了它们的应用。

 

为了应对这些挑战，山东第一医科大学陈启鑫研究员领导的团队开发出一种新型示踪剂Mito-EFT，首次在单个线粒体水平观察到Mito-EF，并监测Mito-EF活性的动态变化。这种示踪剂为评估线粒体质量和药物筛选提供了有效工具。相关研究成果于2025年1月发表在《Advanced Science》杂志上。

 

 

研究材料与方法

在这项研究中，研究人员设计出一种Mito-EF示踪剂（Mito-EFT），并利用来源于hUCMSC细胞的外泌体来包装Mito-EFT。他们在HeLa细胞上开展了多项实验，包括细胞毒性分析、耗氧率测定、共定位分析等。利用结构光照明显微镜（SIM），他们观察了线粒体的结构和Mito-EFT的定位。他们还委托赛业生物敲除了HeLa细胞中的DRP1，以确定DRP1蛋白是否参与了Mito-EF重定位。

 

技术路线

设计Mito-EF特异性荧光探针，并评估其标记Mito-EF的能力

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评估线粒体形态与Mito-EFT信号之间的关系，并分析线粒体动态变化过程中的Mito-EF分布

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探究DRP1蛋白是否参与Mito-EF重定位，以及如何调节Mito-EF活性

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设计基于Mito-EF的荧光成像药物筛选方法，并在小分子药物上进行验证

 

研究结果

Mito-EF特异性荧光探针的设计

 

研究人员以香豆素为基本骨架，基于正电荷和二乙氨基等结构设计出Mito-EFT探针。这种探针被包装在外泌体内，以促进跨膜递送并最大限度地减少细胞膜的荧光干扰（图1）。在正电荷的引导和线粒体膜电位的吸引下，探针到达并停留在线粒体内膜上。通过二乙氨基对质子的响应，Mito-EFT探针可逆捕获电子信号传导，清晰地描绘出线粒体内膜上的Mito-EF活性（图1）。

 

图1. 响应线粒体电子流的荧光探针示意图

 

他们发现，Mito-EFT对HeLa细胞的毒性影响可忽略不计。在进入细胞后，Mito-EFT利用其靶向线粒体嵴区域正电荷的能力，显示出与线粒体特异性染料Mito-tracker的共定位。不过与Mito-tracker不同的是，Mito-EFT标记的红色颗粒表现出不均匀的分布。这种定位模式在不同的细胞系中保持一致。这些结果证实了Mito-EFT能够准确定位线粒体内膜区域，对目标测试对象做出响应。此外，Seahorse分析也证实了Mito-EFT与Mito-EF的可逆结合。

 

Mito-EF集中在线粒体裂变和融合位点

接下来，研究人员探究了线粒体形态与Mito-EFT信号之间的关系。他们假设，Mito-EFT的异质性分布可能与线粒体的形状有关。为了验证这一假设，他们用Mito-EFT和Mito-tracker对细胞进行了双重染色分析。他们观察到，Mito-EFT标记的荧光呈现出不规则分布。纤维状健康线粒体内的荧光信号更高，而甜甜圈样和圆形受损线粒体内的荧光分布较弱，表明受损线粒体的Mito-EF活性较低，而健康线粒体的Mito-EF活性较高。

 

为了探究线粒体动态变化过程中的Mito-EF分布，研究人员记录了线粒体裂变和融合事件。值得注意的是，当Mito-tracker标记的单个线粒体分裂为两个不同线粒体时，Mito-EF表现出不同的定位模式，其特点是信号集中在裂变位点（图2A，红色箭头）。随着裂变的进行，Mito-EFT从非裂变区域转移至裂变区域，表现出强烈的荧光积累。在裂变结束后，Mito-EF活性下降。在线粒体融合过程中，融合位点观察到Mito-EF活性增强。这些结果证实，Mito-EF聚集在高活性区域，特别是线粒体裂变和融合位点，在线粒体质量控制中发挥积极作用。

 

 

图2. Mito-EF主要定位在线粒体裂变和融合位点

 

Mito-EF活性受到DRP1蛋白调控

众所周知，参与线粒体质量控制的关键蛋白（比如DRP1）位于线粒体裂变位点，对线粒体稳态有显著影响。为了进一步探究DRP1蛋白是否参与了Mito-EF重定位，研究人员委托赛业生物敲除了HeLa细胞中的DRP1。在DRP1-KO细胞中，线粒体表现出过度融合的纤维状形态。同时，DRP1-KO细胞中Mito-EFT标记的荧光信号显著减少，而一些线粒体区域几乎检测不到Mito-EFT信号。这表明DRP1-KO改变了线粒体形态，并阻碍了Mito-EF的活性。

 

为了深入研究DRP1蛋白如何调控Mito-EF活性，他们假设DRP1的缺失可能会破坏线粒体嵴。他们观察到，尽管传统的形态评估工具显示DRP1-KO线粒体向过度融合线粒体亚群转变，但嵴结构几乎不存在。由此可见，观察线粒体形态的传统方法无法捕捉活细胞中的微小变化，在表征线粒体质量和反映嵴结构方面存在局限性。这些结果也支持了Mito-EF信号与线粒体嵴之间的关联，突出了Mito-EFT探针作为线粒体质量评估工具的潜力（图3）。

 

图3. 线粒体质量评估流程的示意图

 

将Mito-EF应用于药物筛选

考虑到形态学参数并不能反映线粒体内部的真实活力，研究人员引入了一种Mito-EF驱动的荧光成像药物筛选方法。在使用一些代表性的氧化磷酸化抑制剂后，Mito-EFT表现出荧光抑制信号，其荧光变化与电子传递链的抑制顺序密切相关。斑马鱼的成像实验也证实了细胞成像结果。随后，他们用这种方法筛选了13种小分子药物。其中，木兰花碱（Magnoflorine）对Mito-EFT的影响最为明显，表明它有潜力作为线粒体靶向药物。总之，他们引入了一种新型的药物筛选方法（图4）。

 

图4. Mito-EF驱动的荧光成像药物筛选方法示意图

 

结论

这项研究引入了一种新方法，有助于了解Mito-EF如何调节线粒体质量控制。利用新开发的Mito-EF示踪剂，研究人员揭示了Mito-EF维持线粒体稳态背后的动态机制。这些发现加深了人们对Mito-EF动态的了解，为探索控制线粒体功能的复杂机制开辟了道路。这些研究还表明Mito-EFT是评估线粒体质量的可靠指标，优于传统的线粒体形态评估方法。

 

原文检索

Ren Y, Wu LL, Song W, et al. Mitochondrial Electron Flow Dynamics Imaging for Assessing Mitochondrial Quality and Drug Screening. Adv Sci (Weinh). 2025 Jan 13: e2410561. https://doi.org/10.1002/advs.202410561