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基因敲入细胞系
赛业生物基因敲入与点突变细胞系采用自主开发的Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统，通过赛业生物优化的α-donor体系将人源化的Cas蛋白、gRNA和donor三组分转染至目的细胞，产生高效同源重组，实现基因敲入或点突变，周期快至8周。
基因敲入细胞系服务流程
项目分析
基因分析
细胞分析
合成与设计
设计合成sgRNA
设计合成donor
转染与鉴定
细胞电转
基因敲入鉴定
细胞单克隆
挑选单克隆株
测序分析
PCR扩增
Sanger测序分析
复检及扩增
二次细胞检查
细胞扩增培养
基因敲入细胞系服务内容
| 类型 | 典型细胞系 | 交付标准 | 质量控制QC | 项目周期 | 订购 |
|---|---|---|---|---|---|
| 肿瘤免疫细胞 | THP-1, Jurkat, HepG2, SK-MES-1等 | 1个单克隆纯合子细胞株2管（10⁶/管），实验报告 | PCR+Sanger测序 | 快至8周 | |
| 非癌永生化细胞 | HSF, AC16等 | 1个单克隆纯合子细胞株2管（10⁶/管），实验报告 | PCR+Sanger测序 | 快至8周 | |
| 诱导多能干细胞 | iPSC | 1个单克隆纯合子细胞株2管（10⁶/管），实验报告 | PCR+Sanger测序+免疫荧光 | 快至8周 | |
| 干细胞 | H1, H9 | 1个单克隆纯合子细胞株2管（10⁶/管），实验报告 | PCR+Sanger测序+免疫荧光 | 快至12周 |
基因敲入细胞系服务优势
基因敲入细胞系服务案例
1. 点突变细胞株自研的α-donor系统在不同细胞中的编辑效率
| 细胞类型 | Cellpool HDR效率 | 测序峰图 | 单克隆纯合子阳性率 |
|---|---|---|---|
| HEK293人胚肾细胞 | 13% |  | 高达35% |
| NCI-H1299人非小细胞肺癌 | 37% |  | |
| IPSC诱导多能干细胞 | 46% |  |
2. SCARB1（p.K500N, K508N）双位点突变
SCARB1是高密度脂蛋白（HDL）的主要受体，促进肝脏从HDL摄取胆固醇。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，将肝癌细胞的SCARB1突变成SCARB1（p.K500N, K508N）。如图所示，在点突变附近设计sgRNA和包含点突变的Donor，利用α-donor体系将gRNA和Donor递送到Huh-7细胞中，cell pool检测到的HDR效率为40%，通过制备单克隆获得Huh-7/SCARB1（p.K500N, K508N）双位点突变纯合子克隆。
图1. SCARB1（p.K500N, K508N）双位点突变构建图
SCARB1 WT序列:
T
TT
T
GCTTCCTGCAGCACAGAGCC
C
TTGGG
SCARB1 突变序列:
G
TT
C
GCTTCCTGCAGCACAGAGCC
G
TTAGG
图2. Cell pool HDR效率40%
图3. Huh-7/SCARB1（p.K500N,K508N）双位点突变单克隆纯合子
3. 点突变细胞系构建
赛业生物利用CRISPR-Pro技术构建的THP-1 StingQ273E/Q273E，经过Sanger测序验证点突变成功完成（见图1）。THP-1 Sting Q273E/Q273E点突变细胞系被发表在《Molecular Cell》上。
MT sequence：
GGAGTACGCCACCCCCTTGCAGACTTTGTTTGCCATGTCA
GAG
TAC
TCT
CAAGCTGGCTTTAGCCGGGAGGATAGGCTTG
Wild type sequence：
GGAGTACGCCACCCCCTTGCAGACTTTGTTTGCCATGTCA
CAA
TAC
AGT
CAAGCTGGCTTTAGCCGGGAGGATAGGCTTG
1D9：
图4. THP-1StingQ273E/Q273E点突变构建图
注意：
红色
标记为“目的突变”，
粉色
标记为“同义突变”。
参考文献：
Liu S, Yang B, Hou Y, et al. The mechanism of STING autoinhibition and activation. Mol Cell. 2023;83(9):1502-1518.e10. doi:10.1016/j.molcel.2023.03.029
