HFD+CCl4诱导的代谢障碍相关性脂肪肝炎MASH(NASH)小鼠

代谢功能障碍相关性脂肪肝炎（MASH），之前称为非酒精性脂肪肝炎（NASH），是一种慢性肝脏疾病。这种疾病通常源于代谢障碍相关性脂肪肝病（MASLD）、肥胖或糖尿病等，导致肝脏脂肪积累，异常的脂肪堆积可进一步引起炎症。如果没有及时干预会发展成肝脏纤维化，可能会进展为肝硬化或肝癌（HCC）。

HFD+CCl4诱导的MASH（NASH）小鼠构建方式

60%的高脂饮食（HFD）饲养C57BL/6小鼠12-16周以成功构建饮食诱导肥胖（DIO）模型，呈现肥胖、高血脂等症状，通过为期4-6周的CCl4诱导可使肝脏发生纤维化病变。使用Resmetirom（瑞司美替罗）每天灌胃治疗或Semaglutide（司美格鲁肽）每周皮下给药三次后，试验终点分析体成分、血脂四项及病理学等，发现均可显著降低高血脂、肝脏脂质堆积、纤维化等表型。

图1. HFD+CCl4诱导的MASH(NASH)小鼠研究概况

Resmetirom在HFD+CCl4诱导的MASH（NASH）小鼠上的药效验证

图2. 给药期间小鼠体重的变化曲线及试验终点肝重指标。HFD诱导12-16周的小鼠体重和肝重均升高，其中体重可达40g以上。治疗四周后，Resmetirom可显著降低动物体重和肝重。*P<0.05，与高脂饮食对照组差异显著。数据表示为平均值±标准误。*P<0.05视为具有统计学意义，采用单因素方差分析。

图3. 小鼠总胆固醇（TC）水平、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。HFD诱导的小鼠均可显著提高血清中TC、HDL-C和LDL-C的水平，治疗中期和试验终点Resmetirom可降低由高脂饮食诱导的血清中TC、HDL-C和LDL-C的水平。数据表示为平均值±标准误，n=5。#P<0.05、##P<0.01和####P<0.001与正常饮食对照组比较；*P<0.05、**P<0.01与高脂饮食+CCl4组比较，采用单因素方差分析。

图4. 丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平及天门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。治疗期间给予CCl4后检测肝功指标，发现CCl4显著提高了ALT和AST的水平，治疗组的Resmetirom降低了CCl4诱导的血清中ALT和AST水平。数据表示为平均值±标准误，n=5。#P<0.05、## P<0.01与正常对照组比较；*P<0.05、**P<0.01与高脂饮食+CCl4组比较，采用单因素方差分析。

图5. 小鼠肝脏病理组织学检测结果：HE染色、NAS评分、ORO染色与PSR染色。4周治疗后，Resmetirom保护了HFD和HFD+CCl4诱导的肝脏脂肪变性和气球样变。蓝色箭头表示脂肪变性，绿色箭头表示小叶炎，黑色箭头表示气球样变。脂肪变性（0-3分）、小叶炎症（0-3分）、气球样变（0-2分）、NAS评分（0-8分）。数据表示为平均值±标准误，n=5。

图6. 肝α-平滑肌肌动蛋白α-SMA （Acta2）mRNA及一型胶原蛋白（Collagen 1α1） mRNA的水平表达。4周治疗后，Resmetirom抑制了由HFD+CCl4显著诱导的肝纤维化标志物的mRNA水平。数据表示为平均值±标准误，n=5。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.001，采用单因素方差分析。

Semaglutide在HFD+CCl4诱导的MASH（NASH）小鼠上的药效验证

图7. 体重及体成分检测分析。每周两次进行体重检测，Semaglutide可以显著降低小鼠体重和脂肪含量。数据表示为平均值±标准误，n=5。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001与正常饮食对照组比较；#P<0.05、##P<0.001、###P<0.001，与高脂饮食+CCl4组比较，采用单因素方差分析。

图8. 肝重及血脂分析。试验终点进行肝脏称量，Semaglutide组可以显著降低肝脏的重量。给药前和给药后，Semaglutide给药组可以显著降低HFD诱导的高血脂症表型。数据表示为平均值±标准误，n=5。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001与正常饮食对照组比较；#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001，与高脂饮食+CCl4组比较，采用单因素方差分析。

图9. H&E染色病理分析。试验终点采集小鼠肝脏进行组织病理学分析，Semaglutide与DIO模型组比较，降低了气球样变（ballooning）及脂肪性变（steatosis）。综合评分后Semaglutide给药组较DIO及DIO+CCl4组显著降低非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD）活动评分（NAS）。黄色箭头表示脂肪变性，蓝箭头表示肝细胞肿胀，红箭头表示淋巴细胞浸润于肝组织不同区域，绿箭头表示中央静脉及门静脉充血，棕箭头表示偶见成纤维细胞增生。数据表示为平均值±标准误，n=5。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001与正常饮食对照组比较；#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001，与高脂饮食+CCl4组比较，采用单因素方差分析。

图10. 天狼星红染色及病理分析。天狼星红染色结果分析，CCl4模型组较DIO模型组显著增加纤维化程度，Semaglutide可显著降低CCl4诱导的肝脏纤维化。黑色箭头表示肝脏组织中中央静脉周围可见较多胶原纤维增生。数据表示为平均值±标准误，n=5。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001与正常饮食对照组比较；#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001，与高脂饮食+CCl4组比较，采用单因素方差分析。

HFD+CCl4诱导的MASH（NASH）小鼠实验结论

高脂饮食（HFD）诱导12-16周的小鼠（DIO）较普通饲料喂养的小鼠增加了体重和肝脏的重量。DIO小鼠血清中的TC、HDL-C和LDL-C的水平显著增加，较好地模拟了MASH的症状。DIO小鼠与四氯化碳（CCl4）的组合可以加速和恶化MASH小鼠模型的病理过程，CCl4缩短了诱导时间，并加重了DIO小鼠肝纤维化。这种模型广泛用于临床前药效研究以评估新药对MASH的治疗和保护作用。Semaglutide对DIO+CCl4诱导的MASH模型具有保护和治疗作用，可以有效减少脂肪变性和纤维化。