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HUGO-Mab™全人单克隆抗体小鼠
赛业生物基于创新性全人抗体药物研发的需求，凭借扎实的技术创新实力，以及自主研发的TurboKnockout® ES打靶技术，采取大片段原位替换策略，替换小鼠体内的VH、VK和VL基因为人源基因，构建了HUGO-Mab™全人单克隆抗体小鼠。该小鼠能够在体内产生具有高亲和力和低免疫原性的全人源抗体，极大加快抗体发现和新药研发过程，这一点已经得到了多家跨国药企、生物制药公司、科研学术机构的验证。
品系名称：V(D)J全人源化抗体小鼠
品系简称：HUGO-Mab™
品系背景：C57BL/6NCya、BALB/cAnCya、SJL
毛色：黑色、白色
用途：全人源单克隆抗体开发
HUGO-Mab™全人单克隆抗体小鼠抗体基因结构示意图
使用TurboKnockout® ES打靶技术，将小鼠Heavy chain可变区替换为人源VDJ可变区全长序列，将小鼠Kappa light chain可变区替换为人源VJ可变区全长序列，将小鼠Lambda light chain替换为人源全长序列（VJ+C）。
图1. HUGO-Mab™全人单克隆抗体小鼠抗体基因结构示意图
HUGO-Mab™小鼠是赛业生物通过在C57BL/6NCya背景上，将（i）小鼠抗体重链和Kappa轻链可变区序列在原位被替换为人源可变区基因序列，不表达小鼠V(D)J序列，但保留了小鼠恒定区编码基因和调控元件，以支持抗体类型转换；另外将（ii）小鼠Lambda轻链可变区及恒定区序列全部替换为人源基因序列，不表达小鼠Lambda轻链序列。HUGO-Mab™小鼠中含有所有的人源抗体可变区序列，其多样性丰富。面对抗原刺激时，能够产生与野生型小鼠相同水准的强烈免疫反应，产生高效价和多样性抗体。
HUGO-Mab™全人单克隆抗体小鼠品系特点
抗体V(D)J可变区
序列全人源化
序列全人源化
免疫功能健全
B细胞功能正常
保留了天然的
抗体功能
抗体功能
HUGO-Mab™全人单克隆抗体小鼠免疫建议
建议免疫周龄：6-8w
健康级别：Specific Pathogen Free (SPF)
HUGO-Mab™全人单克隆抗体小鼠模型优势
- 基于赛业自主研发的TurboKnockout® ES打靶技术。
- 重链、κ轻链和λ轻链可变区基因的全长序列原位替换，可以表达完整的人类免疫球蛋白基因。
- 保留了天然的抗体功能，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖的细胞毒性（CDC）等功能。
- 直接生成结构为全人源的抗体，无需后续修饰，缩短药物开发周期。
- 共有【重链+仅κ轻链】、【重链+仅λ轻链】和【重链+κ&λ轻链】三种小鼠可供选择。
- C57BL/6、BALB/c和SJL背景品系均可提供，适合多类靶点开发。
HUGO-Mab™全人单克隆抗体小鼠模型验证数据
HUGO-Mab™小鼠能够在体内产生具有高亲和力和低免疫原性的全人源抗体，在功能活性方面优于FDA批准的标准疗法。
1. 生长曲线
小鼠离乳分笼后，每周同一时间对小鼠的体重进行称量，其间维持稳定的环境条件，包括温度、湿度和光照，避免外界干扰影响小鼠生长，根据时间和体重变化，使用数据分析软件绘制小鼠的生长曲线。
图2. HUGO-Mab™小鼠生长曲线。随着周龄增长，小鼠体重逐渐增长，且增长趋势与C57BL/6NCya小鼠一致，体重区间一致，外观一致。
2. 抗体序列多样性检测
采集Naive状态小鼠的脾脏，提取脾脏RNA，对样本提出的total RNA检测合格后，进行文库构建，结合高通量测序技术，全面评估免疫系统的多样性。对测序得到的序列采用质控软件进行质量控制并过滤测序背景，然后与IMGT免疫细胞受体库的V(D)J基因比对，搜索相应的基因片段，寻找精确的V(D)J基因片段和序列的位点，统计分析V(D)J基因频率，克隆频率分布，多肽序列数目和CDR3长度分布等信息。
图3. HUGO-Mab™小鼠脾脏B细胞中重链抗体序列VDJ重排表达检测。对Naive状态小鼠脾脏RNA进行建库，测序分析重链抗体可变区序列多样性。结果表明HUGO-Mab™小鼠重链抗体可变区序列多样性丰富，且各个家族使用频率与人体中重链抗体家族使用频率类似。
图4. HUGO-Mab™小鼠脾脏B细胞中Kappa轻链抗体序列VJ重排表达检测。对Naive状态小鼠脾脏RNA进行建库，测序分析Kappa轻链抗体可变区序列多样性。结果表明HUGO-Mab™小鼠Kappa轻链抗体可变区序列多样性丰富，且各个家族使用频率与人体中Kappa轻链抗体家族使用频率类似。
图5. HUGO-Mab™小鼠脾脏B细胞中Lambda轻链抗体序列VJ重排表达检测。对Naive状态小鼠脾脏RNA进行建库，测序分析Lambda轻链抗体可变区序列多样性。结果表明HUGO-Mab™小鼠Lambda轻链抗体可变区序列多样性丰富，且各个家族使用频率与人体中Lambda轻链抗体家族使用频率类似。
图6. HUGO-Mab™小鼠脾脏B细胞中重链抗体序列可变区CDR3长度分布。对Naive状态小鼠脾脏RNA进行建库，测序分析重链抗体可变区序列CDR3长度，结果表明HUGO-Mab™小鼠Heavy chain可变区CDR3的长度分布呈正态分布，与人体CDR3长度分布规律相符合。
3. 免疫细胞检测
采集Naive状态小鼠的脾脏，将细胞置于含封闭抗体（如Fc Block）的溶液中孵育，防止非特异性结合，按照抗体说明书的推荐浓度加入荧光标记的抗体，在冰上孵育20～30分钟，避免光照，再用PBS缓冲液清洗细胞，去除未结合的抗体。设置好激光器和滤光片参数，确保与抗体荧光匹配，将染色的细胞样品上机，按设置的参数检测荧光信号，使用流式细胞仪软件采集数据，并保存数据文件进行数据分析。
图7. HUGO-Mab™小鼠脾脏组织中的B、T、NK和Macrophage细胞比例正常。取HUGO-Mab™小鼠的脾脏组织，对其T、B、NK和Macrophage细胞的组成进行代表性流式细胞免疫表型分析及统计对比。检测结果显示HUGO-Mab™小鼠脾脏组织中的B细胞（CD3-CD19+）、T细胞（CD3+CD19-）、NK细胞（CD3-CD335+）和Macrophage细胞（Cd11b+F4/80+）与WT小鼠无明显差异。
4. 抗原免疫
用重组蛋白与弗氏佐剂乳化后对HUGO-Mab™和野生型小鼠进行皮下多点注射，每两周加强免疫一次。二免，三免，四免后一周采集小鼠血清，通过ELISA实验检测血清中的抗体效价。
图8. HUGO-Mab™小鼠免疫反应。包被抗原，1:1000起始梯度稀释血清，加入Anti-mouse IgG Fc二抗进行检测。HUGO-Mab™小鼠显示出与野生型C57BL/6N小鼠相当的抗体效价水平。以上是四种不同治疗靶抗原A、B、C和D的免疫效价检测结果。
5. Anti-PD-L1抗体的动态亲和力检测
基于ForteBio分子互作系统来表征抗人PD-L1全人源抗体与人PD-L1的结合动力学。使用HIS1K传感器固化人PD-L1 His蛋白，按照一定浓度稀释待测抗体。
图9. Anti PD-L1动态亲和力。结果显示HUGO-Mab™小鼠产生的全人源抗体分子具有与Atezolizumab相当的亲和力水平。
6. 体外功能检测
将DC与PBMC细胞按照一定浓度混合，加入不同浓度的检测抗体，培养5d后取上清用于检测IL2和IFNγ的含量。
图10. Anti PD-L1 MLR 实验。结果表明HUGO-Mab™小鼠产生的全人源抗体分子具有激活T细胞的功能。
7. 体内功能验证
采用重度免疫缺陷小鼠，将NCI-H358细胞接种于小鼠的右后背处，接种前一天，小鼠尾静脉注射PBMC细胞，每周给药2次，每周统计2次肿瘤大小。
图11. Anti PD-L1肿瘤抑制模型验证。结果显示HUGO-Mab™小鼠产生的全人源抗体分子具有抑制肿瘤细胞生长的功能。
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